二硝基苯胺類除草劑對單頭切花菊‘白扇’的倍性誘導(dǎo)效果

楊惠婷　陳桂信　胡計紅　吉玉婷　康建坂　潘騰飛　佘文琴

摘 ?要：以日本單頭切花菊‘白扇無菌苗的帶腋芽莖段為材料，選用2種二硝基苯胺類除草劑（二甲戊靈和氟樂靈）溶液在不同濃度和浸泡時間下進(jìn)行誘導(dǎo)處理，并接種到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)完整植株。通過早期突變形態(tài)、根尖細(xì)胞染色體計數(shù)、葉片氣孔特征、農(nóng)藝性狀和開花的形態(tài)觀察統(tǒng)計和對比，總結(jié)出除草劑對切花菊‘白扇無菌莖段的誘導(dǎo)效果。結(jié)果表明：200 μmol/L二甲戊靈和200 μmol/L氟樂靈分別浸泡36 h和24 h時誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率達(dá)25.00%和40.00%。經(jīng)誘導(dǎo)的變異植株普遍染色體數(shù)增多，農(nóng)藝性狀變化明顯。變異植株的葉片氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞增大，氣孔密度減小，株高和節(jié)間長度明顯縮短，莖粗、葉長、葉寬顯著增大，舌狀花瓣形態(tài)出現(xiàn)多種明顯變化且數(shù)量增多。

關(guān)鍵詞：切花菊;化學(xué)誘導(dǎo);二硝基苯胺;非整倍體;白扇

中圖分類號：S682 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Ploidy Induction Effect of Dinitroaniline Herbicides on the Single-headed Cutting Chrysanthemum ‘Iwa-no-hakusen

YANG Huiting1， CHEN Guixin1#， HU Jihong1， JI Yuting1， KANG Jianban2， PAN Tengfei1， SHE Wenqin1*

1. School of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Pingnan County United Front Work Department， Pingnan， Fujian 352301， China

Abstract： In this study， the stalk bud stems of Japanese single-headed cutting Chrysanthemum ‘Iwa-no-hakusen sterile seedlings were used as the materials， and two dinitroaniline herbicides （pendimethalin and trifluralin） were used at different concentrations and soaking time. Induction treatment was carried out and inoculated into rooting medium to induce whole plants. The ploidy inducing effect of herbicide on the sterile stem segment of cutting Chrysanthemum ‘Iwa-no-hakusen was summa-rized by statistical analysis and comparison of early mutant morphology， chromosome count of root tip cells， leaf stomatal characteristics， agronomic traits and flowering morphology. The results showed that the induction effect was the best when induced by 200 μmol/L pendimethalin and 200 μmol/L trifluralin for 36 h and 24 h， the induction rate was 25.00% and 40.00%. The number of chromosomes in the plants increased， and the agronomic traits changed significantly. The leaf guard cells and stomata of the mutant plants increased， the stomatal density decreased， the plant height and the internode length were significantly shortened， the stem diameter， leaf length and leaf width increased significantly， and the shape of the tongue petals showed various changes and the number increased.

Keywords： cutting Chrysanthemum; chemical mutagenesis; dinitroaniline; aneuploid; Iwa-no-hakusen

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.007

菊花（Chrysanthemum morifolium）屬菊科菊屬，多年生宿根花卉，原產(chǎn)自中國。菊花品種繁多，觀賞性強(qiáng)，文化內(nèi)涵深遠(yuǎn)，是深受人們喜愛的切花種類，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培?！畮r之白扇是夏季種植的單頭切花菊品種，引種自日本，國內(nèi)簡稱‘白扇?！咨然^潔白飽滿，植株直立纖長，觀賞性優(yōu)良，抗逆性強(qiáng)，尤其耐熱，是福建夏季栽培的單頭切花菊典型代表。在花卉引種過程中，由于地理條件差異和自身生物特性，‘白扇不能完全適應(yīng)新環(huán)境，出現(xiàn)抗逆性降低、品種退化的情況?！咨仍诟＝ㄊ∮认h的引種過程中就出現(xiàn)了因花莖細(xì)弱而導(dǎo)致出口運(yùn)輸時損耗過多和花頭畸變的情況[1]。探究改良‘白扇選育新品種的方法和潛力具有十分重要的意義。

菊花多為高度雜合的異源多倍體，基因型復(fù)雜，染色體數(shù)量不固定統(tǒng)一[2]。菊花基因的復(fù)雜性是其巨大育種可塑性的基礎(chǔ)，近年來國內(nèi)外菊花的育種工作得到長足發(fā)展，引種馴化、雜交育種、誘變育種、分子育種在菊花上都有大量成功案例[3-6]。不僅花型花色有一定改變和創(chuàng)新，生長周期和抗病性方面也培育出很多改良品種。倍性育種的優(yōu)勢主要包括器官組織增大，品種抗逆性增強(qiáng)，次生代謝產(chǎn)物更多，并且倍性改變的植株在一定程度上能夠克服遠(yuǎn)緣雜種不育性[7]。多倍體育種途徑豐富，以秋水仙素誘導(dǎo)體細(xì)胞加倍最為常用，但嵌合體出現(xiàn)較多，對植物及人體的傷害明顯。近年來一些實驗證明[8-10]，一定濃度的二甲戊靈、氟樂靈、甲基胺草磷、戊炔草胺和安磺磷等二硝基苯胺類除草劑在誘導(dǎo)染色體加倍上同樣具有很大的潛力。它們的誘導(dǎo)機(jī)理與秋水仙素相同，都是作用于植物微管蛋白，使有絲分裂中斷，無法正常復(fù)制染色體從而實現(xiàn)染色體加倍。相比于常用的多倍體誘導(dǎo)劑秋水仙素，二硝基苯胺類除草劑對人體的毒害更小，效率更高，且更為經(jīng)濟(jì)實惠，在安祖花[10]、半枝蓮[11]、金線蓮[12]等植物中，均有良好的誘導(dǎo)效果。

因此，本研究選用二甲戊靈和氟樂靈2種毒性較低的二硝基苯胺類除草劑作為誘導(dǎo)劑，對切花菊‘白扇的無菌苗莖段采用浸漬法進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)。比較誘導(dǎo)后切花菊‘白扇染色體數(shù)量、葉片氣孔的變化，以及移栽至大田后，株高、葉片大小、花序大小形態(tài)等農(nóng)藝性狀的改變，了解2種除草劑對誘導(dǎo)切花菊‘白扇的影響，通過采用倍性育種的方法在切花菊中進(jìn)行嘗試，直接或間接地為菊花的育種工作提供思路與技術(shù)參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以福建省尤溪縣三葉花卉農(nóng)業(yè)合作社采集的切花菊‘白扇的帶芽莖段為外植體，經(jīng)離體誘導(dǎo)后接種于生根培養(yǎng)基（1/2 MS+0.03 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂粉，pH 5.8），選取同一批次長勢優(yōu)良且高度一致的無菌苗作為試驗材料。

1.2 ?方法

1.2.1 ?多倍體的誘導(dǎo) ?分別配制50、100、150、200 μmol/L的二甲戊靈和氟樂靈溶液，抽濾滅菌后作為誘導(dǎo)劑避光保存，并用等量無菌水作為對照。同一濃度誘導(dǎo)劑分成4瓶，用于4個不同處理時間。在無菌超凈工作臺上，將長勢良好、高度一致的無菌苗切成1.5～2 cm的帶不定芽點(diǎn)莖段，切去葉片保留葉柄，每瓶放入莖段20個，浸沒于誘變劑中，避光，室溫條件下于150 r/min的搖床分別處理12、24、36、48 h。處理結(jié)束后用無菌水沖洗3次，濾紙吸干水分，接種于生根培養(yǎng)基（1/2 MS+0.03 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5.5 g/L瓊脂粉，pH 5.8），每處理接種10瓶，每瓶接種莖段2個。重復(fù)3次。培養(yǎng)條件：溫度（25±1） ℃，光照強(qiáng)度2500～3000 lx，光照時間12 h/d。

1.2.2 ?多倍體鑒定 ?在接入培養(yǎng)基的20 d進(jìn)行觀察篩選，將能萌發(fā)健康新葉的植株計為成活植株;以發(fā)生明顯形態(tài)性狀變化的植株計為變異植株。

染色體數(shù)目比較：采用常規(guī)壓片法對染色體進(jìn)行制片。選取初步鑒定出的變異植株和對照組的生根苗，于上午9：00 —10：00剪取1 cm長根尖，用飽和對二氯苯溶液在4 ℃條件下預(yù)處理4 h，蒸餾水漂洗2次后在常溫下用卡諾氏液固定24 h，再用1 mol/L的HCl溶液在60 ℃下解離10 min，最后用卡寶品紅溶液染色8～10 min，壓片并將根尖植株敲散成云霧狀。在顯微鏡下（100×）挑選染色體分散良好、染色體形態(tài)清晰以及染色體長度適中的中期分裂相，進(jìn)行染色體數(shù)量統(tǒng)計。變異植株和對照組各統(tǒng)計20個根尖切片，每個切片選取3個細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

葉片氣孔特征比較：選取生長階段相近的變異植株和對照組植株各20株，撕取第5片新葉的葉片下表皮紙片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。每個葉片隨機(jī)選擇6個氣孔，測量氣孔的長度、寬度以及保衛(wèi)細(xì)胞的長度、寬度，并計算平均值，對每個葉片隨機(jī)選取3個視野拍照，統(tǒng)計每個視野（3488 μm×2621 μm）內(nèi)的氣孔數(shù)（對于不完整的氣孔，明顯大于1/2的氣孔計為1個，其余氣孔忽略不計）。

農(nóng)藝性狀比較：將生根苗煉苗移栽后，種于福建省尤溪縣三葉花卉農(nóng)業(yè)合作社的切花菊大棚進(jìn)行統(tǒng)一栽培管理。于盛花期即栽種于大棚的第19周，剔除個別畸形苗和倒伏植株，對健康生長的變異植株和對照組全部單株的株高、莖粗、葉片大小、花序直徑、舌狀花數(shù)等農(nóng)藝性狀指標(biāo)進(jìn)行測量統(tǒng)計。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

用Excel 2010軟件和IBM SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析。

成活率=成活株數(shù)/總株數(shù)×100%

變異率=形態(tài)變異株數(shù)/總株數(shù)×100%

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?2種誘導(dǎo)劑對切花菊‘白扇的誘導(dǎo)效果

根據(jù)對生長形態(tài)的觀察，與對照組相比，部分經(jīng)誘導(dǎo)的‘白扇明顯植株粗壯，葉片明顯變大，葉寬趨近于葉長，以此作為變異植株的初步統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)，得到2種誘導(dǎo)劑對切花菊的誘導(dǎo)情況如表1。從表1可以看出，2種誘導(dǎo)劑處理后，在同種誘變劑處理下，同一時間范圍內(nèi)，隨著誘變劑濃度的升高，成活率降低，變異率升高。在同一濃度的同種誘變劑處理下，也普遍呈現(xiàn)出處理時間越長，成活率降低，變異率升高的趨勢。對照組全部成活且未產(chǎn)生變異植株。當(dāng)二甲戊靈濃度為200 μmol/L，處理時間達(dá)到48 h;氟樂靈濃度為200 μmol/L，處理時間達(dá)到36 h時，變異率明顯下降，甚至不產(chǎn)生變異。這是由于在高濃度長時間處理下，誘導(dǎo)劑對植物的毒害作用過強(qiáng)，一部分植株雖能成活，但是植株細(xì)弱矮小，無法健康生長。從表1還可以看出，對于浸泡法誘導(dǎo)切花菊，200 μmol/L二甲戊靈浸泡36 h時誘導(dǎo)效果最佳，成活率為43.33%，誘導(dǎo)率為25.00%;200 μmol/L氟樂靈浸泡24 h時誘導(dǎo)效果最佳，成活率為51.67%，誘導(dǎo)率為40.00%。分析結(jié)果表明，二甲戊靈和氟樂靈溶液以一定時間和濃度，對切花菊‘白扇無菌苗莖段采用浸泡法進(jìn)行誘導(dǎo)，均能使其產(chǎn)生一定程度的變異。