植物ＲＮＡ干擾抗病毒機制研究進展

方遠鵬 李云洲 岳寧波 趙志博 楊再福 王勇 龍友華

摘 要：目前，植物病毒病危害越來越嚴重，抗病毒研究越來越受到人們的關(guān)注。RNA干擾是植物抗病毒的重要機制之一，但很少有人對其進行系統(tǒng)的研究。RNAi關(guān)鍵蛋白主要包含3種：Dicer樣（DCL）、RNA依賴聚合物（RDR）和Argonaute（AGO）。在抗病毒作用中，DCL1和DCL2、RDR2和RDR6、AGO1是最重要的。si RNAi介導(dǎo)的RNAi是RNAi最主要的機制，主要過程是DCL將ds RNA切割成“初級si RNA”，RDR將si RNA重構(gòu)成ds RNA，然后將新合成的ds RNA切割成更多的“次級si RNA”，AGO與si RNA結(jié)合形成RNA沉默復(fù)合物（RISC）。RNA干擾可以通過互補堿基對切割RISC和靶病毒或RNA核酸序列，最終降解病毒或RNA核酸序列。本文歸納總結(jié)國內(nèi)外RNAi機制相關(guān)蛋白及其功能、以及RNA i抗病毒機制，為植物抗病毒研究提供指導(dǎo)與依據(jù)。

關(guān)鍵詞：RNA干擾;抗病毒機制;Argonaute;Dicer樣;RNA依賴性RNA酶

Abstract：Plant virus diseases are becoming more and more serious， and anti-virus research has attracted more and more attention. RNA interference is one of the important mechanisms of plant resistance to viruses， but few people have systematically studied it. RNAi key proteins mainly include three types： Dicer-like （DCL）， RNA-dependent RNA polymerase （RDR） and Argonaute （AGO）. Among the antiviral effects， DCL1 and DCL2， RDR2 and RDR6， and AGO1 are the most important. si RNAi-mediated RNAi is the most important mechanism of RNAi. The main process is that DCL cuts ds RNA into "primary si RNA"， RDR reconstitutes si RNA into ds RNA， and then cuts the newly synthesized ds RNA into more "Secondary siRNA"， AGO combines with si RNA to form RNA silencing complex （RISC）. RNAi can cut the RISC and target virus or RNA nucleic acid sequence through complementary base pairs， and ultimately degrade the virus or RNA nucleic acid sequence. This article summarizes the relevant proteins and their functions of RNAi mechanism at home and abroad， as well as the antiviral mechanism of RNAi， and provides guidance and basis for plant antiviral research.

Keywords：RNA interference; Antiviral mechanism; Argonaute （AGO）; Dicer-like （DCL）; RNA-dependent RNA polymerase （RDR）

植物受到多種病原微生物的侵染，包括真菌、細菌、病毒、線蟲及其他生物，其中病毒病害防治最為困難，對農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)影響巨大[1-2]。植物病毒主要是通過昆蟲或其他介體進行傳播[3]，最重要的是，植物病毒變異速度很快[4]，治療困難。

植物體自身免疫在抗病毒中發(fā)揮關(guān)鍵作用，RNA干擾（RNA interference，RNAi）是植物抗病毒的重要機制[5-6]。參與RNAi抗病毒機制的蛋白主要有三類：Dicer-like （DCL）、RNA-dependent RNA Polymerase（RDR）和 Argonaute（AGO）。RNAi形成過程可以人為分為三個階段：第一階段，DCL主要負責(zé)將ds RNA剪切加工成‘初級si RNA;第二階段，RDR可以將‘初級si RNA重新反轉(zhuǎn)錄重新合成ds RNA，新合成的ds RNA再次被DCL剪切加工形成更多的‘次級si RNA;第三階段，AGO與si RNA形成RNA沉默復(fù)合體（RIGC），RISC通過堿基互補配對的方式，剪切加工與si RNA匹配的病毒序列。三個階段中的第二個階段由于RDR的參與可以產(chǎn)生更多‘次級si RNA，因此在RNA沉默過程中起信號放大的作用。

1 RNAi相關(guān)蛋白

目前，DCL、RDR和AGO在多種植物中被發(fā)現(xiàn)。DCL蛋白在擬南芥中有4個成員，在番茄有7個，辣椒中有4個[7-8]。DCL在RNAi過程的起始階段，主要參與‘初級si RNA的形成。對于RDR，擬南芥中有6個成員，番茄中有6個，辣椒中有6個[7-8]。RDR在RNAi過程中主要起信號放大的作用，可以將‘初級si RNA重新合成ds RNA，新合成的ds RNA重新被DCL剪切加工成‘次級si RNA。AGO蛋白在擬南芥中有10個，番茄中有15個，辣椒中有12個[8-11]。AGO與si RNA結(jié)合形成RNAi沉默復(fù)合體si RISC，通過堿基互補配對的方式降級病毒。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，植物RNAi的抗病毒防控的認識和運用也取得重要進展。

1.1 DCL蛋白的主要功能

DCL屬于剪切酶，一般具備DEAD盒、RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、DUF283、ds RBD、RNaseⅢ和PAZ六種結(jié)構(gòu)域，低等真核生物可能缺失其中1～2個結(jié)構(gòu)域，其中具有內(nèi)切酶作用的催化域有兩個[13]。

擬南芥中有四個DCL蛋白，分別為DCL1、DCL2、DCL3和DCL4，但是其功能各有差異。擬南芥DCL1通過與mi RNA的前體pre-mi RNA雙向識別，實現(xiàn)mi RNA的合成[14-16]，這個結(jié)果與水稻中研究一致，水稻DCL1蛋白（OsDCL1）基因敲除后導(dǎo)致mi RNA的含量降低[14-16]，該結(jié)果同樣證明DCL1參與mi RNA的合成。擬南芥DCL2與DCL4主要參與植物抗病毒防御[17]，除此之外，ALBERTO等[18]發(fā)現(xiàn)了擬南芥DCL2（AtDCL2）的一種新的可變剪切，暗示AtDCL2可能發(fā)揮其他功能。番茄研究中發(fā)現(xiàn)，DCL2是一個新的抗RNA病毒因子[19]。KONSTANTANA等[20]報道DCL2和DCL3共同在抗馬鈴薯紡錘纖塊莖類病毒（Potato Spindle Tuber Viroid，TSTV）中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在擬南芥AtDCL2、水稻OsDCL2及番茄SlDCL2等DCL2參與抗病毒響應(yīng)和si RNA的形成，其次OsDCL2還被發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)物活躍于水稻卵母細胞內(nèi)，對植物的繁殖具有特殊的作用[21-22]。DCL3對異染色體質(zhì)24nt小RNA和長鏈mi RNA合成有關(guān) [23-24]， 另外DCL3與DCL1共同行使對開花的調(diào)節(jié)[25]，而在番茄SlDCL3缺失突變體中，SlDCL2b和SlDCL4可代替SlDCL3的功能 [26]。DCL4對于在植物細胞中有效誘導(dǎo)RNAi至關(guān)重要[27]，DCL4不僅影響著超過100 nt的長ds RNA裂解為21 nt ds RNA 的過程;還可以識別長鏈ds RNA從而影響不同器官中小RNA的含量[28-29]。

1.2 RDR蛋白的主要功能

RDR酶主要存在一個RdRP結(jié)構(gòu)域，編碼區(qū)域廣，據(jù)報道內(nèi)含子可能編碼多種RDRP成員[30]，RDRP成員在生物及非生物逆境表達會上調(diào)[31-32]。

在病毒互作過程中RDR酶行使放大信號并參與抗病的作用[33-34]，或是DNA甲基化相關(guān)，例如柑橘RDR成員及ZmRDR2 [35-36]。近年來，JIANG等[34]對水稻及水稻條斑病毒RSV的互作過程，發(fā)現(xiàn)OsRDR6應(yīng)答RSV感染過程，抑制了RSV的大量擴增。其次，RDRP通過多種途徑參與著植物與病毒的互作過程之中，LI等[37]證明病毒-作物互作的一條途徑，即植物體內(nèi)的HSP20蛋白的分布受病毒RDRP改變，從而影響著植物的病情。最后RDR蛋白還具備著對部分自然基因和小RNA的調(diào)控作用[38-39]。RDRP成員中RDR2是ds RNA合成過程的Pol IV耦合對象，直接決定RNAi的效率[40]， RDR6與植物-病毒互作過程的RNAi反應(yīng)關(guān)系最為密切[41]。

1.3 AGO蛋白的主要功能

AGO酶一般擁有PAZ及PIWI結(jié)構(gòu)域各一個[52]，一般影響RNA及蛋白與病毒互作的效率[53]，AGO是形成mi RISC的主要參與者，也是側(cè)器官發(fā)育[54]的影響因子，對 si RNA的積累與基因甲基化修飾 [55]和tasi RNA形成 [56]、乃至抗蟲抗病[57-58]特性均有關(guān)聯(lián)。AGOs是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）的催化部分，除了切割靶mRNA的功能之外，AGO還可以抑制mRNA翻譯并介導(dǎo)DNA甲基化 [42-45]。

植物中AGO抗病毒活性成員有所差異，其承擔(dān)的功能也有所差異。擬南芥中具有抗病毒特性的AGO有AGO1、AGO2、AGO4、AGO5、AGO7、AGO10，水稻中具有抗病毒活性的AGO有AGO1、AGO18，而其他植物則不同。擬南芥中AGO1和AGO2是RNAi介導(dǎo)的抗RNA病毒的主要成分[46]。近期發(fā)現(xiàn)AGO1蛋白作用效率可能與P1蛋白有關(guān)[47]。AGO4介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因沉默（TGS）可以提高對幾種RNA和DNA病毒的抗病毒防御該途徑與擬南芥中的RNA依賴性DNA甲基化（RdDM）途徑一樣[48-49]。但是最近的研究表明，脫落酸（ABA）誘導(dǎo)了提高對竹花葉病毒（BaMV）的抗病毒防御能力主要是通過AGO2和AGO3，而不是AGO1[42]。研究顯示AGO4對車前草花葉病毒（Plantago asiatica mosaic virus，PlAMV）具有直接的抗病毒活性， 同時不同植物間AGO在抗病毒途徑中存在著類似的抗病毒作用，矮牽牛（Petunia hybrida）、水稻（Oryza sativa）、黃瓜（Cucumis sativus）便廣泛存在這一機制 [47，50]，而這一機制與白苗[51]在番茄被番茄黃化卷葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）感染后發(fā)現(xiàn)AGO出現(xiàn)的表達上調(diào)所體現(xiàn)的試驗結(jié)果所一致。

DCL、AGO、RDR蛋白共同構(gòu)成植物抗病毒防線的一道防線，而這些RNAi相關(guān)蛋白成員共同對抗生物與非生物脅迫。據(jù)報道辣椒RNAi相關(guān)蛋白受多種植物激素影響，在多種應(yīng)激反應(yīng)下顯著作用[59]。RNAi相關(guān)主要蛋白僅DCL、AGO、RDR蛋白的成員被大量報道，除此之外還有著多種蛋白家族和一些特殊成員可能對RNAi抗病毒途徑產(chǎn)生影響，如EMS處理得到的OsDCL5[60]，會對植株造成多種負面影響，但其分子機制尚不明確。

2 RNAi相關(guān)蛋白的抗病毒機制

2.1 si RNA作用的RNAi

作為RNAi的重要途徑之一，si RNA作用的RNAi也是植物RNAi抗病毒的主要機制。其過程為DCL識別因異源RNA分子形成的內(nèi)源或外源性雙鏈RNA（ds RNA），使其被剪切為3'端突出2 nt的羥基，而5端為磷酸基團的si RNA[61]，隨后DCL酶輔助si RNA與AGO2等結(jié)合形成沉默復(fù)合體si RISC，并使si RNA裂為正義與反義兩條鏈，其中反鏈會留在復(fù)合體內(nèi)啟動堿基互補配對方式同靶基因或靶病毒結(jié)合，沉默的靶基因會被釋放，空置的復(fù)合體尋找未沉默靶基因或病毒進行沉默。如果被釋放的正義si RNA未在釋放后及時降解，RDR會將其重新轉(zhuǎn)化形成ds RNA，新合成的ds RNA再次進入RNAi途徑被DCL剪切加工成更多的‘次級si RNA和AGO裝載形成反義si RNA加強沉默效率[62]。

2.2 mi RNA作用的RNAi

mi RNA作用的RNAi 作為RNAi的重要途徑之一，更能提高RNAi抗病毒效率的重要機制。

其過程為核內(nèi)編碼的mi RNA經(jīng)RNA聚合酶作用下形成pri-mi RNA，后經(jīng)轉(zhuǎn)運蛋白運輸至細胞質(zhì)去除poly（A）尾巴和帽子，形成與si RNA類似的成熟mi RNA*雙鏈，但同si RNA不同的是其具莖環(huán)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的部分配對，而非完全配對[63]。AGO1及其他在mi RNA*迅速形成一個mi RISC沉默復(fù)合體。并且復(fù)合體內(nèi)的配對穩(wěn)定性強的mi RNA正義鏈會降解，而反義鏈會被激活沉默靶基因[64]。

2.3 pi RNA作用的RNAi

pi RNA（PIWI-interacting RNA）作用的RNAi是動物生殖細胞特有的RNAi作用途徑，作用途徑無需Dicer蛋白作用即可完成[65]。

由于AGO家族的PIWI亞家族成員無法同AGO亞家族成員一樣同si RNA及mi RNA結(jié)合形成沉默復(fù)合體，在發(fā)生PIWI亞家族成員的RNAi作用時，pi RNA前體將被PIWI亞家族成員所處理為長度為24～32 nt的成熟pi RNA分子，在經(jīng)初級加工或次級加工途徑后形成可剪切靶標RNA或促進異染色質(zhì)形成等方式沉默靶標基因[66]。

3 RNAi相關(guān)蛋白的研究進展

參與RNAi的蛋白主要有DCL、RDR和AGO蛋白，隨著蟲傳病毒危害的加重，RNAi相關(guān)基因在越來越多的植物中被鑒定與分析，并對其作用機制進行研究，如鹽地堿蓬（Suaeda salsa）[67]、橡膠樹（Hevea brasiliensis）[68]、高粱（Sorghum bicolor）[69] 、豆類[70]等;越來越多的研究發(fā)現(xiàn)RNAi不僅與病毒抗性有關(guān)，而且還是病原真菌的入侵“協(xié)助者”，如核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）利用RNAi抑制植物免疫 [71]。

其次植物的基因逆境表達情況也有較大的進展，黃瓜DCL基因在所有器官中表達均較低，在溫度、ABA和鹽脅迫下均呈現(xiàn)莖和花的高表達，干旱下主要為根或莖的高表達[72]，而這與高粱存在差異，高粱DCL基因在大部分組織呈現(xiàn)高表達，尤其是生殖器官[73]，而這與玉米AGO基因的表達類似[74]。

MIRYAM等[75]研究中發(fā)現(xiàn)，天竺葵線型病毒（PLPV，Pelargonium line pattern virus）導(dǎo)致煙草的無癥狀感染過程，雖然雖然產(chǎn)生了vs RNA的積累，但與DCL及RDR6無關(guān);SUZUKI 等[76]將DCL2和DCL4敲除后導(dǎo)致超氧化物歧化酶1（SOD1）和超氧化物歧化酶2（SOD2）和銅對超氧化物歧化酶（ccs1）mi RNAs降低，最終導(dǎo)致全面壞死。另外APAMIDORI等[77]發(fā)現(xiàn)不同的DCL剪切加工的si RNA大小不同，因此DCL與si RNAs的大小分布有著密切聯(lián)系。

另外RNAi獨特的作用途徑與作用機制在藥物研發(fā)、病蟲防治、基因編輯等方面具備應(yīng)用價值。在藥物研發(fā)方面，ZHANG等[78]研究表明農(nóng)桿菌介導(dǎo)的RNAi系統(tǒng)有助于雷公藤（Tripterygium wilfordii）內(nèi)萜類化合物的合成;在植物改良技術(shù)方面，F(xiàn)RISIO等[79]將RNAi技術(shù)用于育種開發(fā)。在基因編輯方面，LU等[80]發(fā)現(xiàn)抑制植物內(nèi)源RNAi 會提高CRISPR / Cas9編輯系統(tǒng)效率。在病蟲害控制方面，SHEN等[81]發(fā)現(xiàn)RNAi途徑可有效阻斷朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）的發(fā)育，TWORAK等[82]認為DCL基因與固氮細菌或病菌感染期間激活存在差異。

4 展望

近年來，隨著研究方法和植物病毒病情的發(fā)展，更多的研究人員對RNAi途徑的抗病毒特性進行利用，如李云洲[83]通過RNAi技術(shù)干擾病毒CP與Rep蛋白抗TYLCV，隨后又進一步證實RNAi相關(guān)基因可以被SA和TYLCV侵染誘導(dǎo)表達[7]，暗示SA誘導(dǎo)的植物病毒抗性可能是通過誘導(dǎo)RNAi通路其作用的。其次，吳嬌[72]通過RT-qPCR方法分別發(fā)現(xiàn)黃瓜AGO家族基因均受鹽脅迫誘導(dǎo)表達。

然而，隨著研究的不斷深入，對植物脅迫因素的認識不斷深入[84]，對生物逆境相關(guān)RNAi途徑重要蛋白功能的認識越來越透徹，卻仍有一些問題尚未解決：（1）目前關(guān)于對于RNAi重要蛋白的功能認識大多局限于擬南芥、煙草等模式作物，其他非模式植物較少進行基因敲除等機理的驗證。而在不同生物體間存在遺傳差異，不同植物間的RNAi重要蛋白作用是否產(chǎn)生特化值得進一步研究;（2）RNAi抗病毒途徑中大多關(guān)注AGO1、DCL1、DCL2、RDR2、RDR6這一部分蛋白，對其他同家族蛋白關(guān)注則較少，運用多種手段發(fā)現(xiàn)其他同家族蛋白的抗病毒活性，以及RNAi途徑中是否存在具替代功能的替代蛋白值得進一步探索;（3）RNAi抗病毒途徑的研究大多基于普通的分子生物學(xué)手段，其在不同發(fā)生階段的研究不夠全面，運用系統(tǒng)生物學(xué)的方法，通過多組學(xué)和新技術(shù)對RNAi抗病毒途徑下的基因-RNA-蛋白-代謝物的系統(tǒng)互作網(wǎng)絡(luò)研究是一個值得關(guān)注的方面;（4）病毒危害導(dǎo)致的產(chǎn)量或品質(zhì)的改變是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一大問題，RNAi是植物體對病毒的重要免疫途徑，而如何科學(xué)地運用RNAi技術(shù)去指導(dǎo)實踐和服務(wù)農(nóng)林生產(chǎn)，需要研究人員深思。

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