UHPLC-MS/MS法測(cè)定大鼠血漿中山萘酚的藥物濃度及藥動(dòng)力學(xué)研究

肖丹丹，衣 潔，王曉穎，段青婭，李 倩

0 引言

山萘酚(kaempferol)又名山萘素、山萘黃素、山柰黃酮醇、貓眼草素、百蕊草素Ⅲ、四羥基黃酮，屬于黃酮醇類化合物[1-2]，主要來(lái)源姜科植物山萘的根莖，廣泛存在于各種植物的根、葉及果實(shí)中，是銀杏葉提取物中重要的活性成分[3-5]。山萘酚的分子式為C15H10O6,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。山萘酚具有如抗癌、抗氧化、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗菌、抗病毒、抗癲癇、抗風(fēng)濕等多種藥理活性[6-12]，目前在臨床治療上具有較好的應(yīng)用前景。雖然目前國(guó)內(nèi)外已有采用高效液相色譜法(HPLC)來(lái)測(cè)定山萘酚的質(zhì)量濃度，但因其靈敏度低、專屬性差等，不能滿足生物樣品檢測(cè)的要求。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)測(cè)定大鼠血漿中山萘酚的質(zhì)量濃度，用于山萘酚在大鼠體內(nèi)的血藥濃度檢測(cè)及藥代動(dòng)力學(xué)研究，進(jìn)而為體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及臨床研究提供參考依據(jù)。

圖1 山萘酚化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent超高效液相色譜儀-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1290超高效液相色譜儀，Agilent 6430A質(zhì)譜儀)，配有API4000三重四級(jí)桿及電噴霧離子化源(ESI)；S4202S型精密天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；SK7200LH型超聲儀(上海千載科技有限公司)；CJ15RE型低溫離心機(jī)(日本HITACHI公司)；Vortex-Genie2型渦旋儀(美國(guó)Scientific Industries)。

1.2 試劑 山萘酚對(duì)照品(西安天豐生物有限公司，含量98.2%，CAS號(hào)：520-18-3)，和厚樸酚對(duì)照品(阿拉丁，含量≥98%，CAS號(hào)：35354-74-6)，乙腈、甲醇(色譜純，MERDA，美國(guó))，異丙醇、甲酸(色譜純，TEDIA，美國(guó))，羧甲基纖維素鈉(分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雄性SD大鼠[(180±10)g]，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。該動(dòng)物中心已經(jīng)通過(guò)國(guó)際動(dòng)物委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 采用ZORBAX SB-C18(2.1 mm×30 mm，3.5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～8.0 min，30%A；8.0～15.0 min，30%A→90%A；15.0～16.0 min，90%A→30%A；16.0～20.0 min，30%A)，流速為0.3 ml/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為5 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧ESI離子源，選擇負(fù)離子掃描方式及多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式測(cè)定，離子源噴霧電壓4 000 V，離子源溫度300 ℃，霧化氣15 psi，碰撞氣為高純氮?dú)猓魉贋?1 L/min，碎裂電壓為135 V，碰撞能分別為40 V(山萘酚)、25 V(內(nèi)標(biāo)物)。

2.3 溶液的制備

2.3.1 山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取山萘酚對(duì)照品12.5 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為500 μg/ml的山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液，置4 ℃冷藏備用。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液的制備 精密稱取和厚樸酚對(duì)照品5.0 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為200 μg/ml的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，置4 ℃冷藏備用。

2.3.3 山萘酚對(duì)照品溶液的制備 精密量取上述山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋并制成終濃度為0.4、0.8、20.0、100.0 μg/ml的山萘酚對(duì)照品溶液，置4 ℃冷藏備用。

2.3.4 血漿樣品預(yù)處理 精密量取大鼠血漿100 μl于1.5 ml的離心管中，加入內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液10 μl，渦旋30 s，加入600 μl異丙醇，再渦旋5 min，于10 000 r/min離心10 min，吸取上清液于離心管中，37 ℃氮?dú)獯蹈?，然后加?00 μl甲醇復(fù)溶，渦旋5 min，過(guò)濾，取上清液測(cè)定。

2.3.5 QC樣品的制備 精密量取山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于1.5 ml離心管中，加入100 μl空白血漿，加入10 μl內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，渦旋30 s后，按“2.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制成終濃度分別為0.4、1.5、6.0、12.0、20.0、25.0、50.0、100.0 μg/ml的QC樣品，置4 ℃冷藏備用。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 取空白血漿100 μl，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“2.3.4”項(xiàng)下方法操作，取上清液進(jìn)行UHPLC-MS/MS分析，同時(shí)將一定濃度的山萘酚對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入到空白血漿中，依同法操作,山萘酚和內(nèi)標(biāo)物二級(jí)碎片離子圖見(jiàn)圖2,血漿樣品色譜圖見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，山萘酚與內(nèi)標(biāo)物分離度較好，且內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)待測(cè)組分無(wú)干擾，基線較平穩(wěn)。

3.1.2 基質(zhì)效應(yīng)考察 取空白血漿適量，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“2.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制成空白溶液，再分別加入“2.3”項(xiàng)下的山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，配成終濃度為0.4、0.8、20.0、100.0 μg/ml的QC樣品各6份，進(jìn)樣分析，獲得相應(yīng)色譜峰峰面積，將測(cè)得的峰面積與用甲醇配制的相當(dāng)濃度的各對(duì)照品溶液(含內(nèi)標(biāo))直接進(jìn)樣后所得的面積的百分比計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，該基質(zhì)效應(yīng)符合生物樣品測(cè)定要求，可忽略不計(jì)。

3.1.3 線性關(guān)系、定量下限考察 精密量取山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于1.5 ml離心管中，加入100 μl空白血漿，加入10 μl內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，渦旋30 s，后按“2.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，配成終濃度為0.4、1.5、6.0、12.0、20.0、25.0、50.0、100.0 μg/ml的QC樣品，分別注入液質(zhì)聯(lián)用儀，以QC樣品中山萘酚的濃度為橫坐標(biāo)，山萘酚和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。求得回歸方程為y=0.001 2x-0.000 8(r=0.999 8)，結(jié)果顯示，山萘酚質(zhì)量濃度在0.40～100.0 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為0.4 μg/ml。

圖2 大鼠血漿樣品中山萘酚和內(nèi)標(biāo)物的二級(jí)碎片離子圖

圖3 大鼠血漿樣品中山萘酚和內(nèi)標(biāo)物的色譜圖

表1 山萘酚在大鼠血漿中的基質(zhì)效應(yīng)(n=6)

3.1.4 精密度與準(zhǔn)確度 精密量取山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于1.5 ml離心管中，加入100 μl空白血漿，加入10 μl內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，渦旋30 s，后按“2.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，配成終濃度為0.4、0.80、20.0、100.0 μg/ml的QC樣品各5份，連續(xù)測(cè)定3 d，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿樣品中山萘酚的質(zhì)量濃度，求得日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，方法的準(zhǔn)確度和精密度良好，符合生物樣品測(cè)定要求。

表2 準(zhǔn)確度與精密度測(cè)定結(jié)果(n=5)

3.1.5 提取回收率 精密量取山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液適量于1.5 ml離心管中，加入100 μl空白血漿，加入10 μl內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，渦旋30 s，后按“2.3.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，配成終濃度為0.4、20.0、100.0 μg/ml的QC樣品各5份，進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積A；取空白血漿適量，除不加內(nèi)標(biāo)外，按“2.3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，制成空白溶液，再分別加入“2.3”項(xiàng)下的山萘酚對(duì)照品儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液適量，配成終濃度為0.4、20.0、100.0 μg/ml的樣品各5份，進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積B，以A/B×100%計(jì)算提取回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 提取回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

3.1.6 穩(wěn)定性 按“2.3.4”項(xiàng)下方法配制低、中、高3種濃度(0.4、20.0、100.0 μg/ml)的QC樣品各5份，測(cè)定在3次凍融循環(huán)和室溫放置24 h后的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，山萘酚在室溫條件下放置24 h及3次凍融循環(huán)狀態(tài)下均無(wú)明顯降解。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3.2 分析方法在藥動(dòng)學(xué)中的應(yīng)用

3.2.1 給藥方案及血漿樣品測(cè)定 健康雄性SD大鼠18只，體重約(180±10)g，隨機(jī)分為3組，每組各6只，灌胃給藥。灌胃前禁食12 h，自由飲水，單次灌胃給予50 g/L的山萘酚混懸液(5 g/L的CMC-Na溶液)，給藥劑量依次為150、200、250 mg/kg，分別于給藥前0 h和給藥后0.25、0.5、1、2、4、6、9、12、24、48 h于眼球后靜脈叢取血300 μl，血樣收集到肝素化的1.5 ml EP管中，4 000 r/min離心10 min，分離得到血漿，存于EP管中，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按?.3.4”項(xiàng)下方法處理各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品，進(jìn)樣分析，平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖4。

圖4 山萘酚經(jīng)口服給藥后在大鼠中的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

3.2.2 藥動(dòng)學(xué)評(píng)價(jià) 采用藥動(dòng)學(xué)處理軟件DAS2.0對(duì)藥-時(shí)曲線進(jìn)行擬合,應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表5。

表5 山萘酚經(jīng)口服給藥后大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n=6)

4 討論

目前報(bào)道的有關(guān)山萘酚的體內(nèi)定量分析的文獻(xiàn)較少，并且這些方法具有操作繁瑣、專屬性差、靈敏度低等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子源以及MRM檢測(cè)方式，充分地利用了UHPLC-MS-MS操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的分離能力，用于大鼠血漿樣品中血藥濃度測(cè)定。選擇流動(dòng)相時(shí)，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液，結(jié)果表明采用乙腈-甲酸水溶液作為流動(dòng)相，響應(yīng)較高，峰型良好，背景噪聲低。同時(shí)考察了不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸水溶液對(duì)測(cè)定的影響，發(fā)現(xiàn)隨著甲酸濃度的增加，儀器響應(yīng)變低，因此，最終以乙腈-0.1%甲酸水溶液作為測(cè)定血漿中待測(cè)物的流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-MS/MS法用于山萘酚經(jīng)灌胃給藥后在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究，經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察可知，在0.4～100 μg/ml血藥濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，所測(cè)生物樣品的基質(zhì)效應(yīng)、精密度與準(zhǔn)確度、提取回收率、溶液穩(wěn)定性均滿足生物樣品測(cè)定的要求。該方法簡(jiǎn)單快速、靈敏度及準(zhǔn)確度高，可滿足生物樣品分析的要求，適用于山萘酚在大鼠體內(nèi)的血藥濃度檢測(cè)及藥代動(dòng)力學(xué)研究，為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

根據(jù)藥時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可以看出，經(jīng)灌胃給藥后，山萘酚在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)行為屬于二室開(kāi)放模型，山萘酚經(jīng)口服吸收后迅速入血，但由達(dá)峰時(shí)間可推測(cè)出山萘酚在胃腸道吸收速率較慢，可能與山萘酚較低的溶解度有關(guān)，而山萘酚在體內(nèi)的消除速率較緩慢，可能與藥物代謝P450酶有關(guān)，這也將是我們下一步工作研究的重點(diǎn)。