超臨界CO2萃取印蒿精油工藝優(yōu)化及成分分析

丁仡，李源棟，劉秀明，尹開云，邱杰斐，夏建軍，楊義，段焰青，*

（1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南昆明650202；2.湘潭大學(xué)化學(xué)學(xué)院，湖南湘潭411100；3.昆明香冠科技有限公司，云南昆明650202；4.紅云紅河煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南昆明650202）

印蒿（Artemisia palls Wall.）歸屬于菊科植物蒿屬，始于印度南部地區(qū)，其具有持久的特征微弱膏香和藥香草本植物[1]。印蒿油的主要來源來自印蒿花采用水蒸餾所得，作為食品香料來源，已被多國(guó)引進(jìn)，目前主要用于調(diào)配葡萄干、海棗、果脯、桃子、李子等香精[2]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于印蒿精油成分組成報(bào)道文獻(xiàn)較少[3-6]，這對(duì)了解印蒿精油揮發(fā)性成分組成和應(yīng)用有一定的局限性。

植物油提取方法有很多種，有著各自優(yōu)缺點(diǎn)，其中水蒸氣蒸餾法[7]，蒸汽溫度過高、易使物質(zhì)分解且耗能大；溶劑提取法[8]，精油中含有雜質(zhì)、耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑用量大且難回收；微波輔助提取[9-10]，可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)油成分發(fā)生變化；壓榨法[11]會(huì)將部分雜質(zhì)溶于精油中；超臨界流體萃取法相比于其他方法可以避免對(duì)成分的破壞，避免水解，對(duì)活性成分提取更完全，且采用CO2為萃取溶劑，具有無毒，廉價(jià)以及來源豐富等特點(diǎn)，廣泛用于植物油的提取[12-14]。本研究首次采用超臨界流體萃取法提取不同產(chǎn)地印蒿的揮發(fā)油，通過探討不同操作因素對(duì)萃取效果影響，并采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法結(jié)合保留指數(shù)對(duì)印蒿油進(jìn)行成分分析，為其開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

印蒿：市場(chǎng)；二氯甲烷、甲醇、正己烷（優(yōu)級(jí)純）：百靈威科技有限公司；正構(gòu)烷烴C7～C30：Sigma-Aidrich 公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ZX-FW80 高速萬能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HELIX 超臨界流體萃取儀：Applied separations Inc 公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI 公司；7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent 公司；ME414S 萬分之一電子天平：德國(guó)Sartorius 公司。

1.2 方法

1.2.1 超臨界萃取

取30 g 印蒿用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎并過40 目篩選，干燥后將其放入萃取釜。開通CO2，選擇萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間，收集精油，并通過公式計(jì)算出精油的得率。

萃取率/%=（精油質(zhì)量/印蒿干粉質(zhì)量）×100

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)定萃取壓力為25 MPa，CO2流量為20 L/h，萃取時(shí)間60 min，萃取溫度為35、40、45、50、55 ℃條件下對(duì)精油得率的影響；設(shè)定CO2流量為20 L/h，萃取時(shí)間60 min，萃取溫度為40 ℃，萃取壓力為15、20、25、30、35 MPa 條件下對(duì)精油得率的影響；設(shè)定萃取壓力為25 MPa，萃取時(shí)間60 min，萃取溫度為40 ℃，CO2流量為10、15、20、25、30 L/h 條件下對(duì)精油得率的影響；設(shè)定萃取壓力為25 MPa，CO2流量為20 L/h，萃取溫度為40 ℃，萃取時(shí)間40、50、60、70、80 min 條件下對(duì)精油得率的影響。進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分析萃取溫度、萃取壓力、CO2流量、萃取時(shí)間對(duì)精油得率的影響[15-17]。

1.2.3 印蒿精油成分分析

準(zhǔn)確稱取印蒿精油0.20 g，用甲醇∶二氯甲烷（體積比為1 ∶4）混合溶液稀釋到10 mL，進(jìn)樣前需要將樣品用0.45 μm 有機(jī)相濾膜過濾，直接進(jìn)GC/MS 分析。色譜條件：RXi-5sil MS 石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（純度為99.99 %），流速：1.0 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min；以3 ℃/min 的速率升溫至180 ℃；再以10 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，進(jìn)樣量：1.0 μL，分流比：20 ∶1，溶劑延遲6 min。質(zhì)譜條件：離子源：電轟擊電離（electron impact ion source，EI）源；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280 ℃；掃描范圍：40 m/z~450 m/z，質(zhì)譜檢索圖庫(kù)：NIST 譜庫(kù)。

1.2.4 定性方法

移取正構(gòu)烷烴C7～C30標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷將其稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%溶液，按照1.2.3 儀器操作條件進(jìn)樣，求出正構(gòu)烷烴C7～C30保留時(shí)間，為下一步計(jì)算印蒿精油中各成分保留指數(shù)作準(zhǔn)備。

根據(jù)Vanden Dool 和Kratz 的線性程序升溫的保留指數(shù)原理，利用自編軟件求得保留指數(shù)（kovats index，KI）值：

式中：tx為被分析組分；tn為碳原子數(shù)；tn+1為n 和n+1 的正構(gòu)烷烴流出峰的保留時(shí)間，min。

樣品印蒿精油經(jīng)過GC/MS 分析后，利用儀器自帶的NIST 質(zhì)譜庫(kù)對(duì)印蒿精油中化學(xué)成分進(jìn)行自動(dòng)檢索，然后通過云南中煙技術(shù)中心開發(fā)的保留指數(shù)軟件求出各成分保留指數(shù)，將軟件計(jì)算的保留指數(shù)與精油數(shù)據(jù)庫(kù)中保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)（可接受誤差不超過3%），對(duì)其進(jìn)行定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度印蒿單因素分析

2.1.1 萃取溫度

設(shè)定萃取壓力為25 MPa，CO2流量為20 L/h，萃取時(shí)間60 min，萃取溫度為35、40、45、50、55 ℃條件下，得出溫度對(duì)精油得率影響的折線圖，見圖1。

由圖1 可知，溫度在超臨界流體萃取中，溫度升高分子熱運(yùn)動(dòng)加快，溶劑揮發(fā)和擴(kuò)散系數(shù)提高增加了分子間的締合幾率，使得萃取率提高。但另一方面溫度過高時(shí)，分子間的間距增大，密度減小，不利于傳質(zhì)作用，并可能將易分解的物質(zhì)分解從而降低萃取得率。

圖1 萃取溫度對(duì)萃取率的影響Fig.1 Influence of extraction temperature on extraction rate

2.1.2 萃取壓力

設(shè)定CO2流量為20 L/h，萃取時(shí)間60 min，萃取溫度為40 ℃，萃取壓力為15、20、25、30、35 MPa 條件下，得出萃取壓力對(duì)精油得率影響的折線圖見圖2。

圖2 萃取壓力對(duì)萃取率的影響Fig.2 Influence of extraction pressure on extraction rate

由圖2 可知，萃取壓力增大，萃取物的溶解度隨之增加，內(nèi)部分子間的相互作用能急劇增大，使之更加接近油脂內(nèi)部分子間的作用能。但當(dāng)壓力過大時(shí)，CO2密度太大反而會(huì)降低傳質(zhì)效率。

2.1.3 CO2流量

設(shè)定萃取壓力為25 MPa，萃取時(shí)間60 min，萃取溫度為40 ℃，CO2流量為10、15、20、25、30 L/h 條件下，得出CO2流量對(duì)精油得率影響的折線圖，見圖3。

圖3 CO2 流量對(duì)萃取率的影響Fig.3 Influence of CO2 flow rate on extraction rate

由圖3 可知，當(dāng)CO2流量增大時(shí)，CO2與物料的接觸面積增大，提高了溶質(zhì)密度和傳質(zhì)速度。當(dāng)流量過大時(shí)，物料與CO2接觸不夠充分，擴(kuò)散速度不夠無法萃取到溶劑中，使得萃取效率降低。

2.1.4 萃取時(shí)間

設(shè)定萃取壓力為25 MPa，CO2流量為20 L/h，萃取溫度為40 ℃，萃取時(shí)間40、50、60、70、80 min 條件下得出萃取時(shí)間對(duì)精油得率影響的折線圖，見圖4。

圖4 萃取時(shí)間對(duì)萃取率的影響Fig.4 Influence of extraction time on extraction rate

由圖4 可知，隨著時(shí)間的增加，CO2與物料接觸時(shí)間更為充分，萃取效率增加，當(dāng)達(dá)到一個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，物料中的精油大部分被萃取出，往后的效率幾乎無變化。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

結(jié)合2.1 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以印蒿精油得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取萃取溫度（45、50、55 ℃）、萃取壓力（25、30、35 MPa）、CO2流量（20、25、30 L/h）、萃取時(shí)間（50、60、70 min）進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化印蒿精油提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表如表1所示，結(jié)果如表2 所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Horizontal table of orthogonal test factors

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

由表2 可知，考察4 個(gè)重要因素指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)的影響大小排序?yàn)镈＞C＞B＞A，最優(yōu)組合為A2B2C3D2，既萃取溫度為50 ℃、萃取壓力30 MPa、CO2流量30 L/h、萃取時(shí)間60 min，在此條件下，通過多次試驗(yàn)得出精油平均得率2.26%，得率優(yōu)于正交試驗(yàn)中的得率，因此最優(yōu)組合為A2B2C3D2。并采用上述條件提取英國(guó)印蒿精油，得率為2.32%。

圖5 印度印蒿精油氣相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖Fig.5 GC/MS total ion flow chromatography of India Artemisia palls Wall.oil

2.3 印蒿精油成分分析

印蒿精油中成分經(jīng)GC/MS 檢測(cè)所得到總離子流色譜圖見圖5~圖6，其結(jié)果采用Nist11 進(jìn)行檢索后結(jié)合香精保留指數(shù)進(jìn)行對(duì)比對(duì)其定性，利用面積歸一化法[18]計(jì)算得出印蒿精油中各成分相對(duì)百分含量，結(jié)果見表3。

通過質(zhì)譜庫(kù)檢索，結(jié)合精油數(shù)據(jù)庫(kù)輔助定性，提高了天然化合物定性準(zhǔn)確性，減少了誤判和錯(cuò)判。對(duì)檢索出的化合物進(jìn)行定性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)許多醇類、烷烯類等化合物，若僅用質(zhì)譜庫(kù)檢索定性會(huì)難以判定甚至誤判，尤其是同系物和同分異構(gòu)體的確定[19]。

圖6 英國(guó)印蒿精油氣相色譜/質(zhì)譜總離子流色譜圖Fig.6 GC/MS total ion flow chromatography of English Artemisia palls Wall.oil

表3 印蒿精油成分分析Table 3 Composition analysis of Artemisia palls Wall.oil

續(xù)表3 印蒿精油成分分析Continue table 3 Composition analysis of Artemisia palls Wall.oil

通過質(zhì)譜庫(kù)檢索和人工圖譜解析，結(jié)合保留指數(shù)比對(duì)，從印度印蒿精油中共鑒定出28 個(gè)化合物，占印蒿精油成分82.90%，其中烯烴類11 個(gè)，酯類5 個(gè)，醇類6 個(gè)，醚類1 個(gè)，酮類2 個(gè)，其它化合物3 個(gè)，主要成分包括：印蒿酮（36.585%）、大根香葉烯B（11.52%）、肉桂酸乙酯（6.45 %）、印蒿醚（5.46 %）、β-桉葉油醇（1.91%）、β-芹子烯（1.68%）、肉桂酸甲酯（1.30%）等化合物，其中酮類化合物含量最為豐富，占精油成分48.43%；從英國(guó)印蒿精油中共鑒定出40 個(gè)化合物，占印蒿精油成分83.80%，其中烯烴類16 個(gè)，酯類9 個(gè)，醇類7 個(gè)，醚類1 個(gè)，酮類2 個(gè)，醛類1 個(gè)，酚類1 個(gè)，其它化合物3 個(gè)，主要成分包括：印蒿酮（45.37%）、大根香葉烯B（11.78%）、肉桂酸乙酯（5.66%）、印蒿醚（4.27%）、β-芹子烯（2.52%）、肉桂酸甲酯（1.45%）、2，6，6-三甲基-1-亞甲基-2-環(huán)己烯（1.37%）等化合物，其中酮類化合物含量最為豐富，占精油成分45.45%。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看到，不同產(chǎn)地印蒿精油成分具有一定的相似性但各組分的相對(duì)百分含量具有較大的差異。

3 結(jié)論

采用超臨界萃取技術(shù)對(duì)印蒿油進(jìn)行提取，并以精油得率為指標(biāo)來優(yōu)化萃取工藝條件，通過正交試驗(yàn)得出超臨界最佳提取工藝條件；利用氣相色譜/質(zhì)譜法，對(duì)提取印蒿精油成分進(jìn)行分析，通過質(zhì)譜庫(kù)檢索及保留指數(shù)驗(yàn)證。從印度和英國(guó)印蒿精油中分別鑒定出28、40 種化合物，占總峰面積82.90%和83.80%，主要成分為：印蒿酮、大根香葉烯B、肉桂酸乙酯、印蒿醚等，在定性過程中，使用了保留指數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，提高了化合物定性準(zhǔn)確性；本研究結(jié)果為印蒿精油開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。