響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化麗江海棠果果汁飲料配方

童觀珍，樊瑩潤，李澤林，肖麗宏，付曉萍，范江平

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

海棠果富含豐富的黃酮和多糖等活性成分，具有抗衰老[1]、抗腫瘤[2]、抗氧化[3-4]等作用，其藥用價值早在《本草綱目》就有記載：“酸甘平、無毒、治泄痢”[5]。海棠果果實中還含有豐富的常量營養(yǎng)物質(zhì)和微量元素，其中粗蛋白占3.12%，是蘋果、梨的1.5 倍，每100 g 果實含524.70 mg 氨基酸，其氨基酸組成中脯氨酸和天門冬氨酸的占比最大，分別為12.24 g/kg 和11.16 g/kg[6]；并且該果實中的粗纖維占7.48%，粗纖維作為人體不可吸收的膳食纖維，可加快人體的腸道蠕動和代謝，緩解現(xiàn)代人的便秘排毒癥狀；果實中的微量礦物元素鈣、磷、鋅、鐵也大量存在[7]，因此對于海棠果的營養(yǎng)功能特性正引起科研人員的興趣，并對此開展深入研究。目前對海棠果的加工利用已有果酒、果醋、果茶等產(chǎn)品[8-10]，也有從果實中提取天然紅色素等工藝的探究[11]。麗江海棠果（Malus rockii Rehd.），是產(chǎn)自云南省麗江市的一種薔薇科蘋果屬的果實[12]，是云南特有的野生資源，其未成熟果實較為酸澀，成熟后果實呈鮮紅色，口感酸甜可口，細(xì)脆多汁深受當(dāng)?shù)鼐用裣矏?，?jù)當(dāng)?shù)鼐用窠榻B，有關(guān)節(jié)疼痛，兒童小便不暢時，都會食用麗江海棠果來得到緩解。在《中國納西康巴醫(yī)藥學(xué)》中也能夠找到關(guān)于麗江海棠果入藥的證據(jù)。目前麗江海棠果消費方式主要是鮮食，其精深加工產(chǎn)品的開發(fā)利用還很少見報道。

Box-Behnken 設(shè)計簡稱BBD，是響應(yīng)面試驗設(shè)計的常用方法，通過多元二次方程擬合各因素與效應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，對回歸方程的分析來優(yōu)化工藝，解決多種變量關(guān)系；比起正交試驗，它可有效的，預(yù)測性更好的評價因變量和自變量之間的非線性關(guān)系[13]，在藥物有效成分提取、食品加工中被廣泛應(yīng)用[14-16]。因此，本試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 法優(yōu)化麗江海棠果果汁飲料的配方條件，得出最佳的配方，以期為麗江海棠果的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麗江海棠果：產(chǎn)自云南省麗江市玉龍縣拉市鄉(xiāng)，鮮果采摘后，運往云南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品加工工程中心-20 ℃冷庫保存?zhèn)溆谩０咨疤牵汗ⅠR南華糖業(yè)有限公司；β-環(huán)糊精：郁南縣永光環(huán)狀糊精有限公司；檸檬酸：濰坊英軒實業(yè)有限公司；白砂糖、β-環(huán)糊精、檸檬酸均為食品級。

1.2 儀器與設(shè)備

T6 新世紀(jì)紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HX-PB811 破壁機：佛山市海迅電器有限公司；HWS-24 電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BS224S 電子天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；H3-18K 臺式高速離心機：湖南可成儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

麗江海棠果果汁飲料加工工藝流程及操作要點：

1.3.1.1 麗江海棠果果汁的制備

選擇無病無霉?fàn)€、新鮮成熟的海棠果果實清水洗凈、去蒂，按料水比1 ∶3（g/mL）加入超純水，倒入破壁機中破壁3 min，分別用200 目和400 目紗布2 次過濾分離的到澄清透明的海棠果果汁。

1.3.1.2 調(diào)配

按試驗設(shè)計將一定比例的海棠果果汁與白砂糖、檸檬酸、β-環(huán)糊精混合，加水定容至所需體積，混勻后均質(zhì)處理。

1.3.1.3 均質(zhì)

為便于添加劑更均勻的分布在溶液中，同時提高成品的整體感官分值，需用均質(zhì)機對飲料進行均質(zhì)處理，采用20 MPa，均質(zhì)兩次為宜。

1.3.1.4 滅菌

為保證果汁中VC和花青素等營養(yǎng)物質(zhì)不被破壞，采用沸水浴滅菌處理，飲料灌裝封口后，95 ℃下滅菌20 min，室溫25 ℃冷卻或在4 ℃冷庫冷卻得到成品。

1.3.1.5 穩(wěn)定性試驗

將成品置于4 ℃冷庫過夜，通過飲料的透光性來檢測飲料的穩(wěn)定效果。

1.3.2 感官評定方法

配比的優(yōu)劣將從色澤、口感、香氣、組織狀態(tài)4 個方面對海棠果果汁進行整體感官評價，滿分為100 分，其中口感和色澤各為30 分，香氣和組織狀態(tài)各為20分，選擇10 名有食品專業(yè)背景的人員對成品進行感官評價，小組人員身體健康，無不良嗜好，味覺靈敏，在正式評定前進行相應(yīng)指導(dǎo)，果汁的感官評定標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 海棠果果汁飲料感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of Malus rockii Rehd.juice beverage

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

本試驗以風(fēng)味、口感、組織形態(tài)、香氣4 個方面為評價指標(biāo)進行單因素試驗，選取原果汁添加量、白砂糖、檸檬酸、β-環(huán)糊精4 個因素進行單因素試驗，每個因素取6 個水平，各因素水平分別為：果汁（40 %、50%、60%、70%、80%、90%），白砂糖（0%、2%、4%、6%、8%、10%），檸檬酸（0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%），β-環(huán)糊精（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）。綜合以上各因素對果汁的感官評價和透光率的影響。

1.3.4 透光率測定

將配置好的海棠果果汁在4 ℃冷庫冷藏過夜，觀察果汁的沉淀情況，后用高速離心機在轉(zhuǎn)速為5 000 r/min條件下離心5 min，取上清用紫外分光光度計在625 nm處測定吸光度[17]，并以超純水為參比，具體計算公式如（1）所示。

式中：A 為飲料的透過率；A0為超純水的透過率。

1.3.5 麗江海棠果果汁配方優(yōu)化

在單因素基礎(chǔ)上，選擇原果汁添加量、白砂糖、檸檬酸、β-環(huán)糊精四因素三水平，以感官分值為指標(biāo)，采用Design-Expert8.0.6 軟件的Box-Benhnken 響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化海棠果果汁飲料的配方，因素水平編碼見表2。

表2 海棠果果汁響應(yīng)面因素水平表Table 2 Response surface factors and levels of Malus rockii Rehd.juice

1.3.6 微生物指標(biāo)測定

菌落總數(shù)的測定：參考GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》；大腸菌群的測定：參考GB 4789.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 原果汁添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響

海棠果原果汁呈鮮紅色，且無明顯沉淀，口感較為酸澀，因此原果汁量對飲料的整體感觀有重要影響，考察果汁用量對海棠果果汁品質(zhì)的影響，如圖1 所示。

圖1 原果汁添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響Fig.1 The effects of raw juice addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由圖1 可知，當(dāng)果汁的添加量達到70%左右時，飲料的口感、色澤評價均較好，而低于此添加量時，則口感稍顯寡淡，風(fēng)味不足，顏色呈粉色，果汁添加量高于80%時，則過于酸澀，整體口感評分不高，其透光率因果汁的增加明顯降低，原因在于果汁原有的天然紅色素和能透過濾布的細(xì)小懸浮物的存在影響了整體的感官和透過率，這說明合適果汁的添加量對提高海棠果果汁感官品質(zhì)有重要影響，原果汁中獨特的風(fēng)味物質(zhì)使果汁的口感濃郁香氣宜人，添加量過大時，酸度過高，且澀味嚴(yán)重，酸甜比失調(diào)，并且飲料中有機酸占比過大會使其整體感官分值降低，同時飲料中的單寧與蛋白質(zhì)分子之間，蛋白質(zhì)與色素會產(chǎn)生聚集而產(chǎn)生沉淀，最終使得飲料的組織狀態(tài)和口感變差[18]，果汁中的總酸可與白砂糖形成適宜的糖酸比，同時考慮到經(jīng)濟成本，原果汁添加量在70%左右為宜。

2.1.2 白砂糖添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響

白砂糖添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響見圖2。

圖2 白砂糖添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響Fig.2 The effects of white sugar addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

海棠果中含有大量的有機酸及果糖，白砂糖可與果汁風(fēng)味物質(zhì)中的果糖產(chǎn)生味覺協(xié)同作用，合理的糖酸比例與飲料的口感密切相關(guān)，由圖2 可知，白砂糖的添加對果汁透光率影響不大，白砂糖已較好的分散在果汁中，在飲料中加入不同比例的白砂糖，當(dāng)添加量為8%時，海棠果飲料的綜合感官品質(zhì)最佳，與不添加白砂糖的組差值20 分，白砂糖添加量少和過多都對飲料的整體感官評分產(chǎn)生較大的影響，可能是適量的白砂糖可與果汁中的風(fēng)味物質(zhì)和甜味物質(zhì)產(chǎn)生良好的協(xié)同作用，香味濃郁，甜味醇厚，但添加量過多時，白砂糖甜度太高過于突出且單一，掩蓋了海棠果果汁原有的風(fēng)味，同時酸甜比比例失調(diào)，整體口感變差。

2.1.3 檸檬酸添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響

果汁飲料生產(chǎn)加工過程中，常因酚類的存在使果汁氧化發(fā)生褐變，檸檬酸作為一種常用的果汁護色添加劑，通過降低果汁pH 值螯合金屬離子，抑制氧化酶活性來達到護色效果，同時作為一種酸味調(diào)節(jié)劑在飲料產(chǎn)業(yè)中發(fā)揮重要作用[19-20]，檸檬酸添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響見圖3。

圖3 檸檬酸添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響Fig.3 The effects of citric acid addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由圖3 可知，當(dāng)檸檬酸添加量為0.04 %時，可與白砂糖和果糖形成協(xié)調(diào)的糖酸比，飲料的感官分值相對更高，不添加或者添加過量都會影響整體的糖酸比，這說明檸檬酸的添加對整體感觀有重大的影響。在其它類型的飲料工藝研究中，如劉雅在蘋果火龍果復(fù)合飲料添加了2%的檸檬酸[21]，而吳鵬僅在荸薺果汁中添加0.1%的檸檬酸[22]，由此可知，不同品種的原料，檸檬酸添加量也不同。依照透光率來看，檸檬酸對海棠果汁透光率影響不大，有可能是放置時間較短，檸檬酸在護色效果上在不同組間的優(yōu)勢不顯著。

2.1.4 β-環(huán)糊精添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響

海棠果原果汁口感較為苦澀，為改善口感，需要對果汁進行脫苦處理，需在果汁中加入β-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精是直鏈淀粉在環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用下生成的一系列環(huán)狀低聚糖的總稱，其脫苦機能在于可與苦味物質(zhì)通過范德華力和氫鍵結(jié)合形成穩(wěn)定的包嵌物，在溶液中十分穩(wěn)定，可以在不影響果汁的營養(yǎng)成分情況下達到脫苦效果[23]；具有易溶于水，無毒，對熱穩(wěn)定等優(yōu)良特性[24]，加上其成本低廉，在食品工業(yè)被廣泛應(yīng)用，β-環(huán)糊精添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響見圖4。

圖4 β-環(huán)糊精添加量對海棠果果汁飲料品質(zhì)的影響Fig.4 The effects of β-cyclodextrin addition on the qualities of Malus rockii Rehd.juice beverage

由圖4 可知，當(dāng)β-環(huán)糊精添加量為0.2%時，品質(zhì)較佳，比不添加綜合感官評分高15 分，且對透光率影響不明顯，可能是β-環(huán)糊精具有穩(wěn)定、增溶的特性使得飲料中的微粒被包被，透明度增加[25]。飲料在較短時間內(nèi)放置，β-環(huán)糊精的包埋作用使果汁無懸浮或沉淀現(xiàn)象產(chǎn)生，因此對于最終的透光率影響并不明顯。

2.2 海棠果汁Box-Behnken 響應(yīng)面結(jié)果與分析

Box-Benhnken 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果見表3。

表3 海棠果果汁最佳配方響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental result of Malus rockii Rehd.juice beverage

利用Box-Behnken 響應(yīng)面對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到感官分值的二次多項回歸方程為：感官分值Y=89.40+0.92A+0.75B+6.83C+4.00D-0.50AC-0.25 AD-0.25BD+2.00CD-5.33A2-5.33B2-9.45C2-8.20D2

海棠果果汁回歸模型方差分析見表4。

由表4 可知該模型是極顯著的（p＜0.000 1），各單因素中一次項C、D，交互項CD 二次項A2、B2、C2、D2高度顯著的，一次項A 一般顯著，其它均不顯著，檸檬酸對海棠果果汁的感官評價影響最大，其次是β-環(huán)糊精，影響最小的是白砂糖，交互項CD 極顯著說明檸檬酸和β-環(huán)糊精相互作用對果汁品質(zhì)有顯著影響，回歸模型的決定系數(shù)為R2=0.986 9 說明該模型擬合度良好，可用此模型作為海棠果飲料工藝的分析和預(yù)測，該模型失擬項P=0.201 3＞0.05 說明失擬項不顯著，用此模型來表明各因素和響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系具有可靠性，各單因素對響應(yīng)值的影響程度主次順序為：檸檬酸＞β-環(huán)糊精＞原果汁添加量＞白砂糖。

表4 海棠果果汁回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of Malus rockii Rehd.juice beverage

檸檬酸和β-環(huán)糊精的交互作用的相應(yīng)面和等高線見圖5 和圖6。

圖5 交互項C 和D 影響海棠果果汁品質(zhì)的響應(yīng)面圖Fig.5 Interaction surface C and D affects the response surface of Malus rockii Rehd.juice quality

圖6 交互項C 和D 影響海棠果果汁品質(zhì)的等高線圖Fig.6 Interaction surface C and D affects the contour map of Malus rockii Rehd.juice quality

由圖5 和圖6 可知，響應(yīng)面和等高線圖都存在頂點，所選范圍存在極值，等高線形狀為橢圓形，說明檸檬酸和β-環(huán)糊精的交互作用顯著，與方差分析結(jié)果基本一致。在響應(yīng)面和等高線在描述檸檬酸和β-環(huán)糊精對感官分值的影響時，固定其中一個因素，感官分值隨另外一個自變量的增大呈先增大后減小的趨勢，規(guī)律與前期的單因素試驗結(jié)果相近。

2.3 海棠果果汁飲料配方的確定

在各因素可選范圍內(nèi)，以感官分值為響應(yīng)值，根據(jù)模型回歸分析可得海棠果果汁的最佳配方為：原果汁添加量為72.20%，白砂糖添加量8.55%，檸檬酸添加量0.05%，β-環(huán)糊精添加量為0.24%，在此優(yōu)化條件下海棠果果汁的理論綜合分值為90.42 分，同時為驗證該模型的可靠性，根據(jù)以上的條件做了3 組重復(fù)驗證試驗，所得最終評分為88.0、89.7、88.2，平均分為88.63，與模型預(yù)測分值接近，說明此次配方所得的成品在色澤、口感和組織狀態(tài)均良好。

2.4 微生物指標(biāo)測定結(jié)果

菌落總數(shù)＜100 CFU/mL；大腸菌群＜1 CFU/mL；符合GB 7101-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲料》的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

麗江海棠果原果汁添加量對感官分值和透光率都有顯著的影響，透光率會隨原果汁的增加而下降，果汁中沉淀率會增加，白砂糖、檸檬酸和β-環(huán)糊精對果汁的感官有較大的影響，原因在于檸檬酸和白砂糖可與果汁中糖分和可滴定酸形成協(xié)調(diào)的糖酸比，而β-環(huán)糊精則起到脫苦穩(wěn)定作用。根據(jù)Box-Benhnken 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明海棠果果汁的最佳配方為：原果汁添加量72.20%，白砂糖添加量8.55%，檸檬酸添加量0.05%，β-環(huán)糊精添加量0.24%，驗證試驗感官平均分值為88.63，與模型預(yù)測值接近，采用此模型配方得到的果汁顏色呈鮮紅色，過夜后果汁依然澄清明亮，無明顯沉淀，酸甜可口，果香味濃郁，同時營養(yǎng)成分得到了較好的保留。在該工藝條件下制得的麗江海棠果果汁飲料酸甜爽滑，改善了海棠果較為苦澀難以入口的問題，為將來麗江海棠果飲料市場和擴大消費人群提供了基礎(chǔ)。