厚樸葉不同極性溶劑萃取物總酚含量及體外抗氧化活性研究

康兆勇，李玉霜，吳過，黃杰林，陳鈺，趙澤洋，馬林，2，*

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽621010；2.四川省生物質(zhì)資源利用與改性工程技術(shù)研究中心，四川綿陽621010）

厚樸（Magnolia officinalis）是我國臨床治療中常用的一味中藥[1]，主要以皮入藥，是著名的“三木藥材”之一。在歷代本草所載正品的藥用部位均為樹皮，未見有葉入藥的記載。厚樸葉資源十分豐富，每年可以再生，已有研究表明，厚樸葉主要含有厚樸酚、和厚樸酚、揮發(fā)油等化學(xué)成分[2]，具有抑菌[3]、抗癌[4]、抗腹瀉[5]、血管調(diào)節(jié)[6]、增強免疫應(yīng)答[7]等藥理活性。同時，厚樸葉中含有的揮發(fā)油、生物堿、黃酮和多糖等活性物質(zhì)，具有良好的抗氧化性[8-10]。此外，不同月份厚樸葉的營養(yǎng)成分有顯著差異，其中9 月份的厚樸葉營養(yǎng)成分指標(biāo)最好[11]。這些研究表明，厚樸葉資源具有潛在的開發(fā)利用價值。薄層色譜-生物自顯影法將薄層色譜分離技術(shù)與生物鑒定技術(shù)相結(jié)合，是一種有效的快速活性篩選方法，目前主要用于抗氧化、抗菌及抑制膽堿酯酶等生物活性的篩選與測定[12]。該技術(shù)利用具有清除DPPH自由基能力的物質(zhì)能將其還原成DPPH-H 而呈現(xiàn)黃色的原理[13]，反映出樣品間的化學(xué)成分的差異和薄層色譜上獲得分離的成分間活性的強弱，且該方法操作較為簡單、耗費低、靈敏度和專屬性都較高，便于普及[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)，乙醇可以作為厚樸葉抗氧化活性物質(zhì)提取的優(yōu)選溶劑，且90%乙醇提取物的抗氧化活性最高[15]。本研究應(yīng)用薄層色譜-生物自顯影技術(shù)快速跟蹤厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位中具有抗氧化活性的部位，并綜合分析其抗氧化活性，為進(jìn)一步分離抗氧化活性物質(zhì)和綜合開發(fā)厚樸樹葉資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

厚樸（Magnolia offcinalis）葉2015 年9 月采自四川省綿陽市平武縣，風(fēng)干粉碎后過20 目篩，室溫（25 ℃）下保存?zhèn)溆谩?/p>

1，1 -二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：梯希愛（上海）化成工業(yè)公司；2，2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azino-bis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulonic acid），ABTS]、福林酚（Folin-Ciocalteu）：上海藍(lán)季生物公司；抗壞血酸（VC）：天津福晨化工試劑公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2，6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠；低速離心機(jī)（SL02）：上海知信實驗儀器技術(shù)公司；調(diào)溫電熱套（ZDHW）：河北省黃驊市中興儀器公司；流水式高速中藥粉碎機(jī)（FL-30）：瑞安市富力中藥機(jī)械廠；紫外可見分光光度計（752）：上海佑科儀器儀表公司。

1.3 方法

1.3.1 厚樸葉不同極性萃取物的制備

取400 g 厚樸葉粉末，按料液比1 ∶8（g/mL），加入90 %乙醇，加熱回流3 h，趁熱抽濾，濾渣重復(fù)提取2次，抽濾后合并3 次濾液，于50 ℃下減壓濃縮回收溶劑，得到乙醇提取物100.72 g。

將厚樸葉提取物加入200 mL 蒸餾水分散，混勻，得到渾濁水懸液，依次用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇分別萃取3 次，每次100 mL，收集石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇不同極性溶劑萃取液，50 ℃減壓濃縮，得到石油醚萃取物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、甲醇萃取物，萃取后剩余部分減壓濃縮得到萃余相濃縮物。

1.3.2 薄層色譜-生物自顯影法定性檢測

分別取90%乙醇提取物、4 種溶劑萃取物（石油醚、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇）和萃余相濃縮物各0.05 g，用無水乙醇溶解，配成1 mg/mL 的供試品溶液。吸取樣品溶液分別點于同一硅膠薄層板上，依次點1、2、3、4、5、6 次，每個樣品3 個平行，點樣后的薄層板，噴以0.04%DPPH 乙醇溶液，于40 ℃下加熱30 min 后，在可見光下檢視[16]。

1.3.3 總酚含量測定

參考周云凱等[17]的方法測定總酚含量。分別取沒食子酸對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 于10 mL 具塞試管中，加入1 mL 福利酚（Folin-Ciocalteu）試劑，混勻，黑暗條件下放置10 min，然后加入1 mol/L 的Na2CO3溶液2 mL，加蒸餾水至5 mL，50 ℃水浴反應(yīng)10 min，在770 nm 處測定吸光度。以沒食子酸的量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位配制成1.0 mg/mL 的樣液，分別取0.1 mL 各樣品溶液于具塞試管中，按測標(biāo)準(zhǔn)品的方法進(jìn)行顯色測定。其總酚含量以每克厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位中的沒食子酸含量表示[18]。

1.3.4 DPPH 自由基清除能力的測定

參考TANAKA 等[19]的方法。取2 mL 厚樸葉乙醇提取物及各極性部位樣液加入1 mL 500 μmol/L DPPH乙醇溶液，振搖混合均勻，在室溫（25 ℃）下避光放置反應(yīng)20 min，于517 nm 波長處測其吸光度，將1 mL 500 μmol/L DPPH 乙醇溶液與2 mL 無水乙醇混合作為空白?？瞻着c樣品均測定3 次，以BHT 和VC作為陽性對照，吸光度調(diào)零為無水乙醇。DPPH 自由基清除率按式（1）計算。

式中：Ab為以乙醇作為空白的吸光度；As為樣品溶液吸光度。

1.3.5 ABTS+自由基清除能力的測定

參考曹清明等[20]的方法略作修改：取7 mmol/L 的ABTS 溶液50 mL 與2.45 mmol/L 的過硫酸鉀溶液50 mL 混合均勻后，將混合液置于室溫（25 ℃）避光條件下反應(yīng)12 h～16 h，形成ABTS+自由基儲備液。使用前將儲備液用磷酸緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）按1 ∶30（體積比）進(jìn)行稀釋，使用PBS 調(diào)節(jié)734 nm處吸光度為0.700±0.002（PBS 作為對照），作為工作液，于30 ℃預(yù)熱備用。取0.2 mL 樣液與4 mL ABTS+自由基工作液混勻，室溫（25 ℃）下避光反應(yīng)10 min 后。測其吸光度，平行測定3 次。ABTS+自由基清除率按式（2）計算。

式中：Ao為4 mL ABTS 溶液與0.2 mL 無水乙醇（樣品溶劑）吸光度；Ai為4 mL ABTS 溶液與0.2 mL 樣品溶液吸光度；Aj為4 mL PBS 與0.2 mL 樣品溶液吸光度。

1.3.6 總還原力測定

參考高義霞等[21]的方法測定總還原力。將厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位配置成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL 的質(zhì)量濃度，BHT 作為陽性對照，測定在波長為700 nm 的吸光度，吸光度越高，總還原能力越強[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

根據(jù)不同濃度樣品的清除率作線性擬合，以待測樣品濃度為橫坐標(biāo)（X），清除率為縱坐標(biāo)（Y）得待測樣品清除DPPH 自由基、ABTS+自由基能力的關(guān)系曲線。計算當(dāng)清除率為50%時所需樣品的濃度作為半清除率（EC50）。所需樣品質(zhì)量濃度越低，表明其半清除率越高，清除效果越好[23]?？傔€原力以700 nm 波長處的吸光度為0.5 時（OD700nm=0.5）的樣品濃度計算，所需樣品濃度越低，表明總還原能力越高。

所有試驗數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗結(jié)果的平均值。采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Origin9.2 進(jìn)行作圖，顯著檢驗（p＜0.05）采用Duncan 極差法，數(shù)據(jù)以±SD 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化活性成分的薄層定性鑒定結(jié)果

厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位薄層色譜-生物自顯影定性鑒定結(jié)果見圖1。

從圖1 黃色斑點的深淺可知，厚樸葉各物質(zhì)均具有一定抗氧化活性，其中正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物黃色斑點最深，說明其抗氧化活性最高，90%乙醇提取物次之，石油醚萃取物、甲醇萃取物、萃余相濃縮物有較低的抗氧化活性；此外，點樣4 次及以上時顏色區(qū)分開始明顯，對厚樸葉抗氧化活性的定性判定具有指導(dǎo)作用。

2.2 厚樸葉乙醇提物及不同極性部位的總酚含量

測定沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.033X+0.067 1（R2=0.997 6），發(fā)現(xiàn)沒食子酸在5 μg～25 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位的總酚含量見表1。

圖1 厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位薄層色譜-生物自顯影定性鑒定結(jié)果Fig.1 Results of thin layer chromatography-bioautography spot plate for ethanol extract and different polar fractions from Magnolia officinalis leaves

由表1 可知，厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位的總酚含量隨萃取溶劑的不同而有所變化。石油醚萃取物的總酚含量最低，為（42.39±0.40）mgGAE/g，萃余相與石油醚萃取物的總酚含量相近（p＜0.05），為（50.31±2.18）mgGAE/g，說明石油醚不能富集酚類成分。乙酸乙酯萃取物的總酚含量最高，為（178.56±11.32）mgGAE/g，其次是正丁醇萃取物，其總酚含量為（144.72±2.62）mgGAE/g，兩者差異不顯著（p＞0.05），但都較高，乙酸乙酯和正丁醇的極性屬于中等到強極性，而強極性的甲醇萃取得到的萃取物總酚含量反而不高，為（76.16±14.58）mgGAE/g，由此反映出，厚樸葉中大部分酚類物質(zhì)屬于中等到強極性，能被中等到強極性溶劑提?。ㄒ掖?、水）和富集（乙酸乙酯、正丁醇）。由表1 可知，各物質(zhì)的總酚含量為：乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞90%乙醇提取物＞甲醇萃取物＞萃余相濃縮物＞石油醚萃取物。

表1 厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位總酚含量和清除自由基EC50 及Fe3+還原力Table 1 Total polyphenol content of ethanol extract and different polar fractions of Magnolia officinalis leaves and scavenging free radicals EC50 and Fe3+reducing power

2.3 厚樸葉乙醇提物及不同極性部位對DPPH 自由基的清除能力

厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位對DPPH 自由基的清除作用測定結(jié)果見圖2。

圖2 厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位對DPPH 自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical scavenging activity of ethanol extract and different polar fractions from Magnolia officinalis leaves

由圖2 可知，厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位對DPPH 自由基均有一定的清除能力，且其清除率在一定濃度范圍內(nèi)（0.05 mg/mL～0.4 mg/mL）呈良好的量效關(guān)系，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時各物質(zhì)對DPPH自由基清除率差異明顯，乙酸乙酯萃取物與正丁醇萃取物清除率分別為92.49%和91.40%，與VC清除率（96.70%）接近，顯著高于BHT（77.24%）。乙醇提取物的清除率為87.21%，高于BHT，說明厚樸葉乙醇提取物本身具有較高DPPH 自由基清除活性，與前期研究相匹配[15]。表1 結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取物[EC50（86.27±0.02）μg/mL]和正丁醇萃取物[EC50（129.36±0.05）μg/mL]的抗氧化能力顯著高于BHT[EC50（199.85±0.01）μg/mL]，但低于VC的抗氧化能力。石油醚萃取物[EC50（377.52±0.02）μg/mL]和萃余相濃縮物[EC50（382.69±0.02）μg/mL]抗氧化能力差異不顯著（p＞0.05），說明其清除DPPH自由基能力相當(dāng)，與其他萃取物相比，其活性均較低?？赡苁怯捎谑兔演腿∥锖洼陀嘞酀饪s物中酚類化合物極性較低，和乙醇提取物和其余萃取物中酚類成分差異較大，導(dǎo)致活性較低。各物質(zhì)清除DPPH 自由基能力為：VC＞乙酸乙酯萃取物＞90%乙醇提取物＞正丁醇萃取物＞BHT＞甲醇萃取物＞石油醚萃取物＞萃余相濃縮物。

2.4 厚樸葉乙醇提物及不同極性部位對ABTS+自由基的清除能力

厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位對ABTS+自由基的清除作用測定結(jié)果見圖3。

圖3 厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位對ABTS+自由基的清除作用Fig.3 ABTS radical scavenging activity of ethanol extract and different polar fractions from Magnolia officinalis leaves

由圖3 可知，厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位對ABTS+自由基均有一定的清除能力，且其清除率在一定濃度范圍內(nèi)（0.025 mg/mL～0.4 mg/mL）呈良好的量效關(guān)系。低濃度時（0.025 mg/mL～0.2 mg/mL），厚樸葉各物質(zhì)對ABTS+自由基的清除能力均低于對照VC和BHT，當(dāng)達(dá)到一定濃度（0.4 mg/mL）時，乙酸乙酯萃取物（99.40%）和正丁醇萃取物（99.33%）對ABTS+自由基的清除能力達(dá)到了VC（98.60%）和BHT（98.48%）的清除能力。質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時，乙醇提取物對ABTS+自由基的清除率與對照的清除率接近，為97.18%，顯著高于其余萃取物和萃余相濃縮物。由表1 可知，各物質(zhì)EC50值差異明顯（p＜0.05），表示各物質(zhì)清除ABTS+自由基能力有顯著差異，乙酸乙酯萃取物的抗氧化能力最高，EC50為（127.20±0.01）μg/mL，顯著高于正丁醇萃取物[EC50（200.98±0.05）μg/mL]，但低于VC[EC50（46.86±0.01）μg/mL]。各物質(zhì)清除ABTS+自由基的能力為：VC＞乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞90%乙醇提取物＞甲醇萃取物＞萃余相濃縮物＞石油醚萃取物。

2.5 厚樸葉乙醇提物及不同極性部位的總還原能力

厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位的總還原能力測定結(jié)果見圖4。

圖4 厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位的總還原能力Fig.4 Total reduction ability of ethanol extract and different polar fractions of Magnolia officinalis leaves

圖4 顯示，厚樸葉乙醇提取物及不同極性部位對Fe3+均有一定的還原能力，且其還原能力在一定濃度范圍內(nèi)（0.05 mg/mL～0.6 mg/mL）呈良好的量效關(guān)系，但對Fe3+的還原力顯著低于陽性對照BHT（p＜0.05）。厚樸葉各物質(zhì)中乙酸乙酯萃取物總還原能力最高，顯著高于正丁醇萃取物和其余物質(zhì)。石油醚萃取物的總還原力最低，萃余相濃縮物的總還原力與其接近，均低于乙醇提取物和其余萃取物。由表1 可知，各物質(zhì)OD700nm=0.5 時的樣品濃度差異顯著（p＜0.05），表示各物質(zhì)對Fe3+的還原能力有顯著差異。各物質(zhì)的總還原能力為：BHT＞乙酸乙酯萃取物＞正丁醇萃取物＞90%乙醇提取物＞甲醇萃取物＞萃余相濃縮物＞石油醚萃取物。

2.6 相關(guān)性分析

2.6.1 總酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

用Pearson 系數(shù)對厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位的抗氧化性與總酚含量測定結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表2。

表2 總酚含量與DPPH 自由基、ABTS+自由基和總還原力測定結(jié)果之間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation coefficients for relationships among total polyphenol contents and DPPH assay，ABTS+assay and total reducing force measurement results

由表2 可知，F(xiàn)olin-Ciocalteu 比色法測定厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位總酚含量的結(jié)果與3 種抗氧化方法的相關(guān)因子大于0.797，表明厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位中的酚類物質(zhì)與其抗氧化能力密切相關(guān)?？偡雍颗cDPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力以及總還原力的相關(guān)系數(shù)分別為0.797、0.866、0.875，有顯著相關(guān)性（p＜0.05）。這顯示出厚樸葉中具有抗氧化活性成分的物質(zhì)很有可能為酚類物質(zhì)。

2.6.2 3 種抗氧化活性指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

比較測定抗氧化能力所用的3 種指標(biāo)，進(jìn)行相關(guān)性分析。由表2 結(jié)果可知，ABTS+自由基清除率和總還原力的相關(guān)因子為0.982，說明這兩種指標(biāo)之間具有極高的相關(guān)性（p＜0.01）。DPPH 自由基清除率與ABTS+自由基清除率的相關(guān)因子為0.784，DPPH 自由基清除率與總還原力的相關(guān)因子為0.769，比ABTS+自由基清除率與總還原力的相關(guān)因子低2 個數(shù)量級，但也表現(xiàn)出較高的相關(guān)性。說明3 種抗氧化測定指標(biāo)相關(guān)性較好，采用這3 種方法可綜合評價厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位的抗氧化活性。

3 結(jié)論與討論

體外抗氧化活性的測定需采用多種方法進(jìn)行綜合評價[24]。本研究采用DPPH 自由基清除體系、ABTS+自由基清除體系和總還原力測定對厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位的抗氧化能力進(jìn)行綜合評價。DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，廣泛應(yīng)用于抗氧化物自由基清除能力的測定，可通過檢測樣品溶液對DPPH·的清除率，表示其抗氧化能力的強弱[25]。ABTS+·通常用于篩選復(fù)雜的活性混合物，如植物提取物、飲料和生物液體[26]。目前已被廣泛地應(yīng)用于親水性和親脂性物質(zhì)總抗氧化能力的測定[27]?？傔€原能力是具有抗氧化性的化合物將Fe3+的形式還原為Fe2+形式，通過添加FeCl3形成普魯士藍(lán)色復(fù)合物亞鐵（Fe2+）形式。因此，測量普魯士藍(lán)在700 nm 處的形成，可測定樣品的還原能力，吸光度越高表示鐵還原力越高[28]。研究表明，厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位均具有抗氧化活性，其抗氧化活性大小與樣品濃度存在良好的量效關(guān)系。在不同的抗氧化體系中，厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位的抗氧化能力有一定差異，這可能與采用的抗氧化體系不同和各物質(zhì)抗氧化成分的構(gòu)成差異有關(guān)。3 種抗氧化評價體系得出，乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性最高，抗氧化活性接近商業(yè)抗氧化劑BHT 和天然抗氧化劑VC，可能與其高的總酚含量有關(guān)。

酚類化合物是植物中分布較廣、活性較高的一類化合物，是天然植物提取物或萃取物中具有抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[29]。本研究測定了厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位的總酚含量，其中乙酸乙酯萃取物的總酚含量最高，為（178.56±11.32）mgGAE/g。前期研究表明，厚樸葉不同溶劑提取物抗氧化活性與其總酚含量成正相關(guān)[15]。已報道的天然產(chǎn)物中總酚含量與抗氧化呈顯著相關(guān)性的文獻(xiàn)很多，如：藍(lán)莓葉[30]、紅薯葉[31]、人參莖葉[32]、柳葉[33]、杜仲葉[34]等。厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位的總酚含量與3 種抗氧化性的相關(guān)性有差異，這種差異是因為不同的自由基的清除機(jī)理不同，同時酚類物質(zhì)和其他化學(xué)成分存在拮抗或協(xié)同反應(yīng)[35]。所以通過一種方法來評價厚樸葉的抗氧化活性是片面的，需要從多角度測定綜合評價厚樸葉的抗氧化活性。

通過薄層色譜-生物自顯影法和3 種抗氧化評價體系定性及定量測定抗氧化活性，得出各物質(zhì)的抗氧化活性表現(xiàn)出較為一致的順序，說明薄層色譜-生物自顯影法可用于抗氧化活性的快速定性分析。厚樸葉乙醇提取物和不同極性部位中，乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性和總酚含量均最高，說明乙酸乙酯可以富集其中的抗氧化活性物質(zhì)，可以利用乙酸乙酯萃取物進(jìn)一步分離其抗氧化活性物質(zhì)。張曉琦等[36]對厚樸樹葉中的酚酸類物質(zhì)進(jìn)行分離，從厚樸葉揮發(fā)油中鑒定出41 種化合物，含量較高的組分為β-氧化石竹烯，4-丙烯基苯酚，喇叭醇，龍腦香等。分離得到了較純的起藥用作用的厚樸酚及和厚樸酚，進(jìn)一步分離得到的抗氧化物質(zhì)可能與這些物質(zhì)相關(guān)。該研究為進(jìn)一步開發(fā)利用厚樸葉資源提供了理論依據(jù)。