靈芝固態(tài)發(fā)酵豆渣的抗氧化特性變化研究

申春莉，沙見(jiàn)宇，李曼，張錦麗

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271000）

豆渣是加工豆?jié){或豆腐后的副產(chǎn)物。中豆委2011年統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)生產(chǎn)豆腐所產(chǎn)生的豆渣約為1 304.6 萬(wàn)噸~1 423.2 萬(wàn)噸。大部分豆渣作為飼料或被丟棄，造成了資源的浪費(fèi)。但是，干豆渣中含有25.4%~28.4%粗蛋白、9.3%~10.9%脂肪、40.2%~43.6%不溶性纖維、12.6 %~14.6 %可溶性纖維和3.8 %~5.3%可溶性碳水化合物，另外豆渣中含有異黃酮、皂苷、磷脂等功能成分[1]，可作為微生物的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基[2]，經(jīng)微生物發(fā)酵后的豆渣成為菌質(zhì)。

食藥用菌在固態(tài)發(fā)酵豆渣過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的酶系統(tǒng)，為自身生長(zhǎng)等生理活動(dòng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。同時(shí)，食藥用菌可以產(chǎn)生多種功能性成分，使豆渣的利用率提高。國(guó)內(nèi)外對(duì)食藥用菌固態(tài)發(fā)酵的研究多集中在生產(chǎn)某一活性成分方面，例如，Li 等[2-3]用羊肚菌作為發(fā)酵微生物，固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)多糖，并研究了其物理化學(xué)特征的變化；Shi 等[4-6]利用香菇固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)多酚，利用靈芝、金針菇固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)多糖，姚珩等[7]利用羊肚菌半固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)多糖。

豆渣經(jīng)食藥用菌發(fā)酵過(guò)程中活性成分及抗氧化特性變化的研究鮮有報(bào)道。本研究以靈芝作為發(fā)酵菌株，采用固態(tài)發(fā)酵的形式發(fā)酵豆渣，研究發(fā)酵過(guò)程中多酚、異黃酮、三萜化合物、還原糖含量的變化，并以總還原力、羥基自由基清除力、DPPH 自由基清除力、ABTS+自由基清除力為指標(biāo)，對(duì)靈芝-豆渣菌質(zhì)的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為豆渣功能性食品的研發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 供試菌株及原料

靈芝（Ganoderma lucidum）菌株：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物試驗(yàn)基地；新鮮豆渣：加工早餐豆?jié){的剩余物，購(gòu)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)一餐廳。

1.1.2 設(shè)備

DHG-9070A 電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPX-250BSH 生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SHA-B 水浴振蕩器：常州智博瑞儀器制造有限公司；R-1001 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；TD25-WS 離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；KQ5200E 超聲清洗器：昆山超聲儀器有限公司；UV755B 分光光度計(jì)：上海佑科儀器儀表有限公司；HH-6 水浴鍋：國(guó)華電器有限公司。

1.1.3 試劑

葡萄糖、濃硫酸、冰醋酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；瓊脂、福林-酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；苯酚、鄰苯三酚：天津市大茂化學(xué)試劑廠；DPPH、ABTS：上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；香草醛：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；高氯酸：天津市鑫源化工有限公司；二硝基水楊酸、氫氧化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、亞硫酸鈉：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；酒石酸鉀鈉：萊陽(yáng)市康德化工有限公司；大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷（均為色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

固體平板培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、馬鈴薯浸膏0.4%、KH2PO40.3%、硫酸鎂0.15%、瓊脂2%。

液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、馬鈴薯浸膏0.4%、KH2PO40.3%、硫酸鎂0.15%。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：將新鮮豆渣105 ℃烘干備用。使用時(shí)，將豆渣的含水量調(diào)節(jié)至60%，分裝與250 mL 三角瓶中，每瓶30 g 豆渣，將封口膜置于三角瓶瓶口，牛皮紙封口，121 ℃滅菌2 h。

1.2 菌種活化與培養(yǎng)

將在試管中保存的靈芝菌絲體轉(zhuǎn)移至固體平板培養(yǎng)基上活化，26 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d 備用。

1.3 種子發(fā)酵與固態(tài)發(fā)酵

取250 mL 三角瓶分裝75 mL 液體培養(yǎng)基，接種5 個(gè)直徑1 cm 的菌苔，于搖床26 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)6 d~7 d。

用移液管吸取4.5 mL 發(fā)酵種子液（接種量15%），轉(zhuǎn)移至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，用玻璃棒攪拌均勻，封口膜封口，26 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11 d，隔天取樣。

1.4 樣品制備

將菌質(zhì)從三角瓶中取出，用液氮研磨，取研磨后的菌質(zhì)10 g，其中5 g 用于測(cè)定含水量，另外5 g 菌質(zhì)用于活性成分及抗氧化特性的測(cè)定。

將5 g 新鮮菌質(zhì)中加入20 mL 濃度為70%的乙醇超聲提取30 min，離心，取上清，重復(fù)提取2 次，合并上清液，減壓濃縮，定容至25 mL。

1.5 菌質(zhì)還原糖、三萜、多酚測(cè)定

還原糖的測(cè)定參考曹金霞[8]的方法；多酚含量測(cè)定采用福林酚試劑法[9]；三萜含量測(cè)定采香草醛-高氯酸法[10]。

1.6 異黃酮含量測(cè)定

制備濃度為2、4、6、8、10 μg/mL 的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，0.45 μm 有機(jī)膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。以色譜峰面積對(duì)進(jìn)樣濃度做線性回歸分析，建立大豆異黃酮標(biāo)淮品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同發(fā)酵時(shí)間的菌質(zhì)提取液過(guò)0.45 μm 的濾膜，置于1.5 mL 進(jìn)樣瓶中。

色譜柱：Inertsil ODS-3 C18（4.6×250 mm）。流動(dòng)相：A-超純水（0.1%乙酸），B-乙腈（0.1%乙酸）。梯度洗脫：0~5 min：15%~18%B；5 min~15 min：18%~21%B；15 min~18 min：21%~25%B；18 min~25 min：25%~28 %B；25 min~28 min：28 %~31 %B；28 min~35 min：31 %~40 %B；35 min~40 min：40 %B；40 min~55 min：40 %~15 %B；55 min~80 min：15 %B。流動(dòng)相流速：1 mL/min。檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。柱溫箱溫度：40 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，260 nm。

1.7 抗氧化測(cè)定

DPPH 自由基清除力參考李汶潓等[11]的方法；羥自由基清除能力參考李致瑜等[12]方法；ABTS+自由基清除力參照范金波等[13]的方法；總還原力-普魯士藍(lán)法參考林琳[14]的方法測(cè)定。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

應(yīng)用Excel 2010 和IBM SPSS Statistics 22 數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），均值多重比較采用Tukey 法，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌質(zhì)中的三萜、還原糖和多酚含量變化

菌質(zhì)中還原糖的變化可以反映菌體生長(zhǎng)過(guò)程中大分子物質(zhì)的降解。發(fā)酵過(guò)程中還原糖、多酚以及三萜含量變化情況見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中還原糖、多酚以及三萜含量變化情況Fig.1 Changes in the content of reducing sugar，polyphenols and triterpenoids in the fermentation process

由圖1 可知，1 d~5 d 時(shí)還原糖含量呈上升趨勢(shì)，由1.64%增加為5.74%，可能是靈芝生長(zhǎng)過(guò)程中以大分子碳水化合物為碳源，誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量的胞外酶（纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等），將纖維素等大分子物質(zhì)降解為小分子物質(zhì)，從而使還原糖含量增加[15]，菌體消耗的還原糖的量低于胞外酶分解水解產(chǎn)生的還原糖的量；5 d~7 d 時(shí)還原糖含量由5.74%下降為5.25%，推測(cè)原因?yàn)榫w以還原糖作為碳源，供菌體合成次生代謝產(chǎn)物，菌體消耗的還原糖的量高于胞外酶分解水解產(chǎn)生的還原糖的量；7 d~11 d 時(shí)還原糖含量由5.25%增加至6.47%，推測(cè)原因?yàn)榫w消耗的還原糖的量低于胞外酶分解水解產(chǎn)生的還原糖的量。

由圖1 可知，1 d~3 d 時(shí)多酚含量降低，由67.66 μg/g下降至63.71μg/g；3 d~5 d 時(shí)多酚含量升高，由63.71μg/g上升至84.91 μg/g；5 d~7 d 時(shí)多酚含量下降，由84.91 μg/g下降至74.10 μg/g；7 d~11 d 時(shí)多酚含量上升，由74.10 μg/g上升至102.79 μg/g；與未發(fā)酵豆渣相比，多酚含量升高了52%。菌質(zhì)分泌代謝產(chǎn)物抵擋環(huán)境的氧化脅迫，分泌次生代謝產(chǎn)物的能力與自身的生長(zhǎng)密切相關(guān)[16]。

由圖1 可知，1 d~5 d 時(shí)三萜含量呈上升趨勢(shì)，由2.09 mg/g 增加至3.94 mg/g，推測(cè)原因?yàn)殪`芝菌絲體生長(zhǎng)產(chǎn)生；5 d~11 d 時(shí)三萜含量呈下降趨勢(shì)，由3.94 mg/g下降至1.22 mg/g，推測(cè)原因?yàn)椋红`芝以三萜類化合物作為代謝底物或代謝的中間物質(zhì)被分解轉(zhuǎn)化。菌質(zhì)中的三萜類化合物包含兩部分：靈芝三萜、大豆皂苷。靈芝三萜是靈芝中分離得到的主要有效成分之一，其脂溶性較高[17]。靈芝三萜具有良好的抗氧化性，具有清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH 自由基、過(guò)氧化氫自由基的能力，同時(shí)也具有與還原力和鐵離子螯合能力[18]。

2.2 菌質(zhì)醇提物中的異黃酮含量變化

大豆異黃酮是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，是大豆中重要的生理活性物質(zhì)。大豆異黃酮中主要含有4 種成分，分別是大豆苷元、染料木素、大豆苷和染料木苷。大豆異黃酮97%左右以糖苷形式存在，其它部分以苷元形式存在[19]。靈芝-豆渣菌質(zhì)中異黃酮的含量變化如圖2、圖3 所示。

1 d~3 d 時(shí)，大豆苷、染料木苷的含量下降，大豆苷含量由557.92 μg/g 下降至136.95 μg/g，染料木素含量由1143.25μg/g 下降至146.14 μg/g；1 d~3 d 時(shí)，大豆苷、染料木素含量上升，大豆苷含量由1 643.12 μg/g 上升至1 660.45 μg/g，染料木素含量由2 480.59 μg/g 上升至2 523.76 μg/g。3 d~7 d 時(shí)，4 種異黃酮的含量均呈下降趨勢(shì)；7 d~11 d 時(shí)，異黃酮含量接近0。豆渣中的異黃酮主要以配糖體形式存在，發(fā)酵后，微生物產(chǎn)生的纖維素酶系中β-1，4-葡萄糖苷酶降解配糖體生成異黃酮配基。但從發(fā)酵前后來(lái)看，總大豆異黃酮含量下降，這與姚英政[20]的研究結(jié)果一致。推測(cè)原因?yàn)楫慄S酮作為靈芝發(fā)酵的底物被降解或轉(zhuǎn)化。

圖2 異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品和菌質(zhì)異黃酮的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of isoflavone standards and isoflavones in fermented okara

圖3 靈芝發(fā)酵豆渣過(guò)程中菌質(zhì)中的異黃酮含量變化Fig.3 Changes of isoflavones content of fungal substance in Ganoderma lucidum-fermented okara

2.3 菌質(zhì)醇提物的抗氧化活性變化

不同的抗氧化方法具有不同的反應(yīng)機(jī)理，選擇不同的抗氧化方法是為了更為確切和全面的評(píng)價(jià)谷物多酚提取物的抗氧化活性。靈芝-豆渣菌質(zhì)醇提物（稀釋25 倍）的DPPH 自由基清除力、羥基自由基清除力、ABTS+自由基清除力、總還原力如圖4 所示。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中菌質(zhì)抗氧化活性變化情況Fig.4 Changes in antioxidant activity in fungal substance during fermentation

發(fā)酵的1 d~3 d 時(shí)菌質(zhì)醇提物的DPPH 自由基清除率呈上升趨勢(shì)，由22.54%上升至51.00%；5 d~11 d時(shí)菌質(zhì)醇提物的清除能力呈波浪型變化，第9 天出現(xiàn)1 個(gè)峰值，清除力為49.80%。菌質(zhì)醇提物DPPH 自由基清除率的變化規(guī)律與菌質(zhì)中的還原糖和多酚含量變化規(guī)律一致，說(shuō)明二者在DPPH 自由基清除力方面起主要作用。夏樂(lè)晗等研究發(fā)現(xiàn)杏果實(shí)發(fā)育過(guò)程中總酚含量與清除DPPH·的能力呈顯著正相關(guān)[21]，與本研究結(jié)論相似。多糖中的鼠李糖和三萜也具有較高的DPPH自由基清除力[22-23]，本研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵前期三萜對(duì)DPPH 自由基清除力可能具有一定貢獻(xiàn)，還原糖的種類對(duì)DPPH 自由基清除力的影響還需要進(jìn)一步研究。

羥基自由基清除力呈波浪式變動(dòng)。發(fā)酵前5 d，羥基自由基清除力變化較小，5 d~7 d 時(shí)羥基自由基清除力快速上升，在第7 天達(dá)到峰值，清除力為35.46 %；7 d~9 d 時(shí)清除力下降，由35.46%下降至28.30%；9 d~11 d時(shí)清除力略有增加。羥自由基是一種氧化能力很強(qiáng)的自由基，壽命很短，幾乎可氧化細(xì)胞內(nèi)的一切有機(jī)物和無(wú)機(jī)物，破壞膜系統(tǒng)，引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，有氧化效率高、反應(yīng)速度快等特點(diǎn)，對(duì)生物體危害極為嚴(yán)重[22]。

第1 天發(fā)酵菌質(zhì)的ABTS+自由基清除率最大，為49.89%，1 d～3 d 時(shí)菌質(zhì)醇提液對(duì)ABTS＋自由基的清除能力下降，由49.89%降為41.45%，3 d～11 d 時(shí)清除能力緩慢上升，11 d 時(shí)菌質(zhì)醇提物的自由基清除力為47.46%。ABTS+自由基清除能力的不同表明發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化性與其抗氧化物的種類和含量有關(guān)。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵產(chǎn)物的種類、比例以及含量都會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行而變化，因此捕獲自由基的能力可能有變化[16]。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總還原力呈上升趨勢(shì)，吸光度由0.165 增加至0.481，第9 天還原力達(dá)到最大值；9 d～11 d 時(shí)還原力略有下降。菌質(zhì)醇提取物的總還原力與還原糖的變化規(guī)律相一致。還原酮類可提高總還原力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用靈芝為發(fā)酵菌株，以鮮豆渣為原料，純種固態(tài)發(fā)酵。發(fā)酵后，三萜及多酚含量升高；糖苷型異黃酮在發(fā)酵前期轉(zhuǎn)化為苷元型異黃酮，發(fā)酵中后期，4 種異黃酮含量降低；菌質(zhì)的抗氧化能力發(fā)生變化，其中發(fā)酵后菌質(zhì)的DPPH 自由基清除力、羥自由基清除力、總還原力提高，ABTS+自由基清除力下降。

靈芝發(fā)酵豆渣過(guò)程中可以產(chǎn)生多酚、三萜等活性成分，發(fā)酵后豆渣的活性成分增加，抗氧化活性提高，可以作為天然的抗氧化劑。