響應(yīng)曲面法優(yōu)化鮮青花椒護(hù)色劑配方

蘆星淼，繆鋼，孫梅，朱毅

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；2.魯?shù)榭h明德農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，云南昭通657000）

花椒（Zanthoxylum L.）可用于治療各種疾病，如高血壓、腹痛、腹瀉、頭痛、痢疾等，另外，也可用作滋補(bǔ)品、調(diào)味品和驅(qū)蟲劑[1]。研究表明，花椒提取液中含有酚類、黃酮類、萜類、蒽醌類和皂苷類化合物[2]，可抑制桃褐腐病菌，并可誘導(dǎo)桃果實(shí)產(chǎn)生抗性[3]，體內(nèi)和體外試驗(yàn)表明花椒和花椒葉提取物對Ⅱ型糖尿病及相關(guān)的并發(fā)癥有顯著的治療價值[2]；從花椒中分離中的活性成分可通過直接作用于血管平滑肌誘導(dǎo)血管舒張[1]；花椒精油對瘧原蟲、嗜人按蚊和中華按蚊具有殺蟲活性[4]，而且花椒精油對葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎具有保護(hù)作用[5]；花椒的莖可能是天然抗氧化劑和抗骨質(zhì)疏松癥的良好來源[6]。

花椒根據(jù)顏色可分為青花椒和紅花椒，但是青花椒的品質(zhì)優(yōu)于紅花椒，青花椒中的麻味物質(zhì)是紅花椒的1.6 倍，揮發(fā)油含量是紅花椒的2.4 倍[7]。鮮青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc）采摘后如果不及時處理極易發(fā)生褐變影響其經(jīng)濟(jì)價值和品質(zhì)[8-9]，但是目前關(guān)于花椒的研究主要集中在花椒提取物的成分及活性方面，青花椒護(hù)色方面的研究主要有張曉寧[10]等用響應(yīng)曲面法，以色差為響應(yīng)值，得到鮮青花椒的最佳護(hù)色工藝為：550 mg/L 的硫酸銅，1 000 mg/L 的抗壞血酸，殺菌時間20 min；張甫生等[11]采用微波和護(hù)色劑結(jié)合的處理方式制得干制青花椒，最佳的處理方式為：微波功率462 W，時間60 s，載料量50 g 對青花椒處理，之后再用含有30%乙醇和0.40%的異抗壞血酸鈉對花椒噴涂處理，室溫陰干，制得的花椒色澤青綠。關(guān)于鮮青花椒護(hù)色劑復(fù)配的研究較少，且使用的護(hù)色劑含有Cu2+，而人體攝入過多的Cu2+會對機(jī)體產(chǎn)生不良影響[12]，所以開發(fā)一種對青花椒護(hù)色效果較好且不含有Cu2+的護(hù)色劑配方是很必要的。

有研究表明光照和酶是影響青花椒干燥變色的主要因素[12]，其本質(zhì)是葉綠素在各種因素的影響下發(fā)生反應(yīng)，最終導(dǎo)致青花椒褐變，葉綠素在酸性的條件下不穩(wěn)定，中性或者弱堿性的環(huán)境對葉綠素具有保護(hù)作用[13-14]，所以選擇碳酸鈉作為護(hù)色劑。Zn2+、Cu2+、Mg2+均可和葉綠素發(fā)生反應(yīng)生成更穩(wěn)定的化合物[15]，Cu2+對葉綠素的護(hù)色效果明顯[16]，但是Cu2+在體內(nèi)積累會產(chǎn)生不良的影響，且硫酸銅不屬于食品添加劑，已被禁止添加于食品中，Mg2+的效果不如Zn2+，故選擇含有Zn2+的葡萄糖酸鋅作為護(hù)色劑，另外葡萄糖酸鋅還可以被用作營養(yǎng)補(bǔ)充劑[17]。抗壞血酸和檸檬酸是常用的抗氧化劑，可選擇抗壞血酸和檸檬酸作為護(hù)色劑。

所以本研究選取碳酸鈉、葡萄糖酸鋅、抗壞血酸和檸檬酸4 種護(hù)色劑，以開發(fā)一種安全有效的護(hù)色劑復(fù)配配方，延緩或降低鮮青花椒的褐變度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮青花椒：由魯?shù)榭h明德農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，7 月中旬采摘置于保溫箱中4 ℃低溫避光運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后去掉枝葉，挑選顆粒完整、顏色均勻青綠、無褐變的新鮮青花椒，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

葡萄糖酸鋅、抗壞血酸：北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；檸檬酸、碳酸鈉、丙酮：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫干燥箱（HGZN-Ⅱ-270）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；紫外分光光度計(jì)（SP-2500）：上海光譜儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)（3H12RI）：湖南赫西儀器裝備有限公司；分析天平（ME204102）：梅特勒.托利多儀器（上海）有限公司；電子天平（DT500E）：常熟市佳衡天平儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 護(hù)色劑及濃度的選擇

單因素試驗(yàn)護(hù)色劑濃度選擇見表1。

表1 單因素試驗(yàn)護(hù)色劑濃度選擇Table 1 Concentration selection of color protective agent in single factor test

1.3.2 單因素試驗(yàn)

稱取鮮青花椒10.0 g，浸泡于20 mL 不同濃度的上述護(hù)色劑中30 min，取出后平鋪于50 ℃鼓風(fēng)干燥箱中30 min，以蒸發(fā)表面的水分并鈍化酶的活性；取出冷卻至室溫，置于塑料PE 自封袋中4 ℃冰箱避光保存，根據(jù)張曉寧等[10]對青花椒的處理，15 d 后測定鮮青花椒的褐變度和葉綠素含量。

1.3.3 Box-Beheken 試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取葡萄糖酸鋅（A）、檸檬酸（B）、抗壞血酸（C）3 個對花椒褐變度影響顯著的因素作為響應(yīng)變量，變量的水平以-1、0、1 表示，以褐變度為響應(yīng)值，利用軟件Box-Beheken 中心組合設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。鮮青花椒護(hù)色劑配方優(yōu)化的的Box-Beheken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2 所示。

表2 Box-Beheken 試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Beheken test

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 葉綠素含量測定

采用分光光度法，根據(jù)胡秉芬等[18]的方法稍作修改，稱取1.00 g 處理過的鮮青花椒樣品，加入2.0 mL 80%丙酮迅速研磨至提取完全，用80%丙酮沖洗并定容至15.0 mL，搖勻；4 ℃，10 000 r/min 離心20 min 后過濾，濾液分別在645 nm 和663 nm 下測定吸光度，根據(jù)下式計(jì)算葉綠素含量（mg/g）。

式中：A645、A633分別是鮮青花椒提取液在645 nm、663 nm 下的吸光度；V 為提取液體積，mL；m 為青花椒鮮重，g。

1.4.2 褐變度測定

根據(jù)消光值法[19]，稱取處理過的鮮青花椒1.00 g置于研缽中，加入2.0 mL 左右的蒸餾水迅速研磨，研磨充分后轉(zhuǎn)移至15 mL 離心管中，用蒸餾水洗滌研缽，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至離心管中，定容至10 mL。于4 ℃，10 000 r/min 下離心20 min，過濾后取上清液在410 nm處測定其吸光值A(chǔ)410，褐變度以10×A410表示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2010 處理，制作圖表，進(jìn)行單因素方差分析；Box-Beheken 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件Design-Expert 8.0.6 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同濃度護(hù)色劑處理對花椒褐變度的影響

探究不同濃度的抗壞血酸、檸檬酸、碳酸鈉、葡萄糖酸鋅對鮮青花椒褐變度的影響，結(jié)果如圖1 所示。

由圖1A 可知，隨著抗壞血酸濃度的增加，鮮青花椒的褐變度呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢，當(dāng)濃度達(dá)到0.60%后，不同濃度的抗壞血酸處理結(jié)果之間不顯著，當(dāng)濃度為0.80%時褐變度最低，與對照組相比褐變度降低56.44%；由圖1B 可知，用不同濃度的檸檬酸處理鮮青花椒，鮮青花椒的褐變度隨檸檬酸濃度的升高先降低再升高，低濃度的檸檬酸就會對鮮青花椒的褐變度產(chǎn)生顯著性影響，褐變度最低時對應(yīng)的檸檬酸濃度為0.50 %，此濃度處理可使鮮青花椒的褐變度降低50.68%；由圖1C 可知，鮮青花椒的褐變度隨碳酸鈉濃度的升高先降低后升高，最佳的使用濃度為0.70%，在該濃度下，鮮青花椒的褐變度與對照組相比降低31.96 %；從圖1D 可以看出，不同濃度的葡萄糖酸鋅處理會影響鮮青花椒的褐變度，當(dāng)濃度為0.07 %時，鮮青花椒的褐變度最低為9.46，與對照組相比降低31.89%。

對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素顯著性差異分析，研究不同護(hù)色劑對鮮青花椒褐變度的影響顯著程度，結(jié)果表明：抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅對鮮青花椒褐變度的影響均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），碳酸鈉對鮮青花椒褐變度的影響未達(dá)到顯著性水平（P＞0.05）。故以褐變度為指標(biāo)可選擇抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅這3 種護(hù)色劑進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.2 不同濃度護(hù)色劑處理對鮮青花椒葉綠素含量的影響

采用分光光度法測定不同濃度的抗壞血酸、檸檬酸、碳酸鈉、葡萄糖酸鋅處理后的鮮青花椒的葉綠素含量，結(jié)果如圖2 所示。

圖2A 表明，鮮青花椒的總?cè)~綠素含量隨抗壞血酸濃度的增加先迅速升高，后升高速度變慢；在抗壞血酸的濃度為0.60%時，總?cè)~綠素含量達(dá)到最大值0.26 mg/g，與對照組相比高44.44%；隨后總?cè)~綠素含量隨抗壞血酸濃度的增加呈下降趨勢；葉綠素a 含量和葉綠素b 含量隨抗壞血酸濃度的變化趨勢與總?cè)~綠素含量基本相同。由圖2B 可知，在檸檬酸的濃度小于0.30%時，鮮青花椒中的總?cè)~綠素含量與檸檬酸的濃度呈正相關(guān)；在濃度為0.30%時，總?cè)~綠素含量達(dá)到最大值0.21 mg/g，與對照組相比高16.67%；隨后總?cè)~綠素含量隨檸檬酸濃度的增加呈緩慢下降趨勢。圖2C表明，鮮青花椒中的總?cè)~綠素含量隨碳酸鈉濃度的增加呈先緩慢升高后緩慢下降的趨勢，在碳酸鈉的濃度為0.50 %時，鮮青花椒中的總?cè)~綠素含量最高為0.23 mg/g，比對照組高27.78%，可能原因是葉綠素在酸性條件下不穩(wěn)定，弱堿性的條件對葉綠素具有保護(hù)作用，隨著碳酸鈉濃度的增加，溶液的pH 值升高，從而失去對葉綠素的保護(hù)作用。圖2D 結(jié)果顯示，在葡萄糖酸鋅的濃度低于0.07%時，鮮青花椒的總?cè)~綠素含量隨葡萄糖酸鋅濃度的升高不斷增加；葡萄糖酸鋅的濃度為0.07%時總?cè)~綠素含量最高；隨后總?cè)~綠素含量呈下降趨勢。

圖2 不同濃度護(hù)色劑處理對鮮青花椒葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of different concentration of Colour preservatives on chlorophyll content of Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc

在圖2 中，鮮青花椒中的葉綠素a 含量、葉綠素b含量與總?cè)~綠素含量的變化趨勢基本相同。對不同濃度的護(hù)色劑處理后，鮮青花椒的總?cè)~綠素含量進(jìn)行單因素顯著性差異分析，結(jié)果表明，抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅對鮮青花椒中的總?cè)~綠素含量的影響顯著（P＜0.05），而碳酸鈉對鮮青花椒的總?cè)~綠素含量影響未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。當(dāng)以總?cè)~綠素含量為檢測指標(biāo)時，可選擇抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅這3 種護(hù)色劑設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇葡萄糖酸鋅（A）、檸檬酸（B）、抗壞血酸（C）這3 個對鮮青花椒的褐變度和綠葉素含量影響顯著的護(hù)色劑作為自變量，以褐變度為響應(yīng)值（Y），利用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Continue table 3 Response surface test design and results

2.2.2 模型與方差分析

用Design-Expert8.0.6 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)方差分析，結(jié)果如表4 所示。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance table

得到的各因素與響應(yīng)值間的回歸模型方程為：。模型的P 值為0.040 6，說明建立的回歸模型顯著；所建立回歸模型的決定系數(shù)R2為0.837 1，說明鮮青花椒褐變度的實(shí)測值與預(yù)測值擬合較好，可用此模型來預(yù)測不同濃度的葡萄糖酸鋅、檸檬酸、抗壞血酸對鮮青花椒褐變度的影響；模型中二次項(xiàng)C2對響應(yīng)值的影響極顯著（P＜0.01），而其他的項(xiàng)對響應(yīng)值的影響并未達(dá)到顯著水平，說明不同濃度的護(hù)色劑之間可能存在相互作用，并非單一的線性關(guān)系；各因素對響應(yīng)值的影響可通過方差分析中的F 值評價，F(xiàn) 值越大，說明對響應(yīng)值的影響越顯著[20]，所以各護(hù)色劑對鮮青花椒褐變度的影響順序?yàn)椋簷幟仕幔酒咸烟撬徜\＞抗壞血酸。

2.2.3 響應(yīng)面分析

采用Design-Expert8.0.6 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析，得到護(hù)色劑葡萄糖酸鋅（A）、檸檬酸（B）、抗壞血酸（C）對鮮青花椒褐變度交互影響的響應(yīng)面，如圖3 所示。

圖3 兩因素交互影響鮮青花椒褐變度的等高線及響應(yīng)面圖Fig.3 Effect of two factors on browning degree of Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc：contour line and response surface diagram

等高線是響應(yīng)面水平方向的投影，反應(yīng)的是各因素之間是否存在交互作用，等高線形狀呈橢圓表示兩因素對響應(yīng)值的交互作用顯著，等高線形狀呈圓形則表示兩因素對響應(yīng)值的交互作用不顯著[20]。圖3b 中的響應(yīng)面結(jié)果顯示A 軸方向的坡度較B 軸平緩，說明檸檬酸對鮮青花椒褐變度的影響較葡萄糖酸鋅大；圖3d中的響應(yīng)面果顯示C 軸的坡度較A 軸平緩，說明葡萄糖酸鋅對鮮青花椒褐變度的影響較抗壞血酸大；圖3f中的響應(yīng)面結(jié)果說明：與抗壞血酸相比，檸檬酸對鮮青花椒褐變度的影響更大。這個結(jié)果與方差分析的結(jié)果一致：護(hù)色劑對鮮青花椒褐變度的影響兩兩之間存在交互作用；各護(hù)色劑對鮮青花椒褐變度的影響順序?yàn)椋簷幟仕幔酒咸烟撬徜\＞抗壞血酸。

經(jīng)分析可知，使鮮青花椒褐變度最低的護(hù)色劑配方為：葡萄糖酸鋅0.07 %，檸檬酸0.46 %，抗壞血酸0.69%，在此護(hù)色劑條件下，鮮青花椒的褐變度為5.88。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)得到對鮮青花椒褐變度影響較大的3 種護(hù)色劑是抗壞血酸、檸檬酸、葡萄糖酸鋅。響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化鮮青花椒的護(hù)色劑配方，得出3 種護(hù)色劑對鮮青花椒褐變度的影響順序?yàn)椋簷幟仕幔酒咸烟撬徜\＞抗壞血酸；得到的最優(yōu)護(hù)色劑配方為：葡萄糖酸鋅0.07%，檸檬酸0.46%，抗壞血酸0.69%，在此護(hù)色劑條件下，鮮青花椒的褐變度為5.88，與放置相同時間不用護(hù)色劑處理的鮮青花椒相比降低6.00 左右，說明使用此護(hù)色劑配方可明顯降低或延緩鮮青花椒的褐變度。此方法雖然可以有效的降低鮮青花椒的褐變，但是Cu2+在機(jī)體積累會產(chǎn)生毒害作用，另外GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中并未將硫酸銅規(guī)定為食品添加劑，而本研究得到的添加劑配方不含有硫酸銅，含有的抗壞血酸、葡萄糖酸鋅一方面可以起到降低鮮青花椒褐變度的作用，另一方面也可作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑，配方中的檸檬酸作為一種酸度調(diào)節(jié)劑，同時還有抗氧化的作用[21]，廣泛用于各類食品中，和抗壞血酸具有協(xié)同作用。所以本研究得到的護(hù)色劑配方既可以顯著降低鮮青花椒的褐變度，同時具有安全、易得、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，可為鮮青花椒的護(hù)色提供理論依據(jù)。