過表達(dá)SlMYB75 對番茄幼苗、果實(shí)及種子的影響

張 振,徐志璇,王麗娜,李 強(qiáng),陳春花,任仲海

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院,山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心/農(nóng)業(yè)部黃淮地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 泰安271018

番茄（Solanum lycopersicum）是世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一。MYB 轉(zhuǎn)錄因子參與植物的生長調(diào)節(jié)、對生物和非生物脅迫的響應(yīng)等。在擬南芥和水稻中，MYB 家族已被鑒定和研究[1,2]。擬南芥R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子MYB15 參與ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，MYB15過表達(dá)株系對ABA 的敏感性增強(qiáng)，抗逆性增強(qiáng)[3]。生長素作為一種重要的激素，在頂端優(yōu)勢、調(diào)控生長及向性等方面有重要作用，擬南芥轉(zhuǎn)錄因子MYB77 響應(yīng)生長素信號，在MYB77突變體中生長素應(yīng)答基因的表達(dá)量顯著下降[4]。研究表明，擬南芥AtMYB33 蛋白能夠結(jié)合在花分生組織特性基因LEAFY啟動子8 bp 的序列上，在開花時(shí)調(diào)控GA 信號[5]。擬南芥R2R3MYB 蛋白FLP 與MYB88 共同調(diào)控生長素輸出載體基因PIN從而來影響根系的向重力性[6]。已有研究證明番茄中MYB74、MYB92、MYB78、MYB102、MYB62、MYB2、MYB64、MYB116、MYB113、MYB11能夠被NaCl 所誘導(dǎo)[7]。番茄SLFSM1 是果實(shí)特異的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，它可以與FSB1和另一個(gè)MYB 轉(zhuǎn)錄因子形成三重復(fù)合物共同調(diào)控細(xì)胞的擴(kuò)增，在SLFSM1高量表達(dá)番茄株系中，果實(shí)小、中果皮薄、中果皮細(xì)胞較小，且還抑制了下胚軸子葉細(xì)胞的伸長[8]。有研究報(bào)道，擬南芥AtMYB30 轉(zhuǎn)錄因子，可以影響ANNs 蛋白介導(dǎo)的特異的胞內(nèi)鈣信號的產(chǎn)生，從而調(diào)控植物響應(yīng)氧化脅迫和熱脅迫[9]。擬南芥AtMYB97，AtMYB101和AtMYB120能夠調(diào)控花粉管接受花粉，從而影響受精作用[10]。過表達(dá)菊花CmMYB2植株較野生型開花延遲，葉片數(shù)目增多，在擬南芥中過表達(dá)CmMYB2，能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱和鹽脅迫的耐受性[11]。

在番茄中過表達(dá)MYB75能夠增強(qiáng)番茄的抗熱性，在煙草中過表達(dá)MYB75能夠增強(qiáng)煙草抗冷性[12]，且MYB75在煙草中異源表達(dá)和番茄中過表達(dá)都能夠分別增加煙草和番茄花青苷的合成，并增強(qiáng)植株的非生物脅迫能力[13]。前人研究表明，在番茄中過表達(dá)MYB75能改變果實(shí)顏色，Kiferle 等在Ailsa Craig（AC）中過表達(dá)MYB75使果實(shí)顏色變?yōu)樽仙?；孟夏等在中? 號中過表達(dá)MYB75能使果實(shí)顏色由紅色變?yōu)槌赛S色，類胡蘿卜素含量顯著提高。

本文發(fā)現(xiàn)在AC 中過表達(dá)SlMYB75能夠改變果實(shí)顏色和大小，種皮以及幼苗下胚軸顏色也亦明顯變化，且能夠提高果實(shí)含糖量以及果實(shí)硬度等。這為進(jìn)一步研究SlMYB75基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以AC 和AC 為背景過表達(dá)SlMYB75的轉(zhuǎn)基因番茄為實(shí)驗(yàn)材料，分別培養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)本部科技創(chuàng)新大樓植物培養(yǎng)室以及光照培養(yǎng)箱中。本研究所使用的的煙草為實(shí)驗(yàn)室保存的本生煙，培養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)本部科技創(chuàng)新大樓植物培養(yǎng)室。

本試驗(yàn)所用的大腸桿菌（E.Coli）菌株為DH5α，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌菌株為LBA4404，由本實(shí)驗(yàn)室自行保存。本實(shí)驗(yàn)所用的載體為克隆載體pEASY-Blunt，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；表達(dá)載體pBI121 由本實(shí)驗(yàn)室自行保存。

1.2 總RNA 的提取以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析

采用TRIZOL 法來進(jìn)行轉(zhuǎn)基因番茄各組織的RNA 提取，以提取的總RNA 為模板，按照北京全式金生物技術(shù)有限公司EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super mix 試劑盒說明書進(jìn)行。PCR 反應(yīng)體系為：1 μL Anchored Oligo(dT)18Primer(0.5 μg/μL)，10 μL 2×ES Reaction Mix，1 μLEasyScriptRT/RI Enzyme Mix，1 μL gDNA Remover，水與RNA 共7 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃15 min，85 ℃5 s；PCR 產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳。熒光定量PCR 使用的儀器為BIO-RAD IQ5，所有PCR 反應(yīng)都設(shè)3 次重復(fù)。PCR 反應(yīng)體系為：2×Realtime PCR Super mix 10 μL，上、下游引物濃度為0.5 μmol·L-1，模板1 μL，加去離子水至20 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃30 s 40 個(gè)循環(huán)[14]。

1.3 轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)可溶性糖含量的檢測

取成熟期轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因果實(shí)各30 個(gè)，用糖度計(jì)進(jìn)行檢測果實(shí)含糖量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，記錄每個(gè)果實(shí)含糖量。本文所有多重比較分析方法均為LSD 單因素方差分析，P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

1.4 過表達(dá)載體的構(gòu)建

克隆的含有BamHI 和SalI 酶切位點(diǎn)的SlMYB75的CDS 片段連接到pEASY 克隆載體上，連接后進(jìn)行大腸桿菌DH5α的轉(zhuǎn)化、用PCR 技術(shù)進(jìn)行陽性克隆菌落的篩選、加入相應(yīng)抗性激素進(jìn)行搖菌、之后送鉑尚公司進(jìn)行序列測序、再提取質(zhì)粒、用限制性內(nèi)切酶BamHI 和SalI 分別酶切測序正確的克隆載體質(zhì)粒和pBI121 表達(dá)載體質(zhì)粒。通過瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切去膠片段，用試劑盒進(jìn)行目的條帶的回收，用T4連接酶將載體與目的片段25 ℃連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。進(jìn)行PCR 檢測后選陽性菌點(diǎn)、進(jìn)行質(zhì)粒提取，再進(jìn)行酶切驗(yàn)證，根據(jù)測序結(jié)果與已知序列比對確認(rèn)，然后用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

1.5 亞細(xì)胞定位

選取BamHⅠ和XhoⅠ兩個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將SlMYB75基因從peasy-Blunt 載體切下，并用試劑盒進(jìn)行回收，對pROKⅡ表達(dá)載體用相同的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切后回收，再用T4連接酶在25 ℃將兩者進(jìn)行連接，之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定陽性克隆。構(gòu)建pROKⅡ-SlMYB75-GFP 載體完成后通過凍融法將質(zhì)粒pROKⅡ-SlMYB75-GFP 和p19 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。在進(jìn)行本生煙的侵染時(shí)，我們采用農(nóng)桿菌注射法。挑取陽性克隆接種到含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基(25 mg·L-1Rif,50 mg·L-1Kan)，以每分鐘220 rpm 在28 ℃振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)12 h。之后將以上兩種農(nóng)桿菌菌液在4000×g 的水平離心機(jī)中離心10 min，懸浮(懸浮緩沖液:10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，150 μmol·L-1As)。p19 的菌液與pROKⅡ-SlMYB75-GFP 菌液等體積混合成一管溶液，在分光光度計(jì)儀器中測定OD600值，并使其在在0.6～0.8 之間。室溫黑暗處靜置3 h 后用去針頭針管注射長勢較好的煙草葉片，48～96 h 內(nèi)觀察結(jié)果。進(jìn)行熒光觀察時(shí)，要撕取出較薄的下表皮進(jìn)行觀察。GFP 經(jīng)488 nm 激光激發(fā)，通過550～590 nm 濾鏡后獲得熒光信號[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlMYB75 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

為了解SlMYB75蛋白的功能結(jié)構(gòu)域，利用SMART[16]工具分析，發(fā)現(xiàn)SlMYB75含有275 個(gè)氨基酸，包含兩個(gè)典型的SANT 結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成了經(jīng)典的R2R3MYB 結(jié)構(gòu)[17]。且含有兩個(gè)簡單的未知功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)以上分析結(jié)果，利用IBS.1.0 軟件繪制如圖1 所示SlMYB75結(jié)構(gòu)：

圖1 SlMYB75 蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.1 SlMYB75 protein domain

2.2 SlMYB75 的亞細(xì)胞定位

為了明確SlMYB75蛋白在細(xì)胞中的作用部位，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，將培養(yǎng)好的帶有SlMYB75與GFP 融合蛋白載體的農(nóng)桿菌注射到煙草葉片，培養(yǎng)兩天后在顯微鏡下觀察融合蛋白在煙草葉片細(xì)胞中的分布部位情況。以空載體注射煙草的結(jié)果作為對照。結(jié)果顯示：SlMYB75蛋白定位在細(xì)胞核中，說明該蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)（圖2）。

圖2 SlMYB75-GFP 在煙草葉片細(xì)胞中的定位（標(biāo)尺長度=20 μm）Fig.2 Localization of SlMYB75-GFP in tobacco leaf cells(Ruler length=20 μ m)

2.3 SlMYB75 基因的遺傳轉(zhuǎn)化、過表達(dá)株系表達(dá)量檢測以及組織表達(dá)特異性分析

為了探究SlMYB75基因在番茄中的功能，我們構(gòu)建了過表達(dá)載體，并在番茄中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。取野生型（wild type,WT）和轉(zhuǎn)基因植株兩個(gè)株系OE1 和OE2 的嫩葉，通過Trizol 法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過熒光定量檢測SlMYB75表達(dá)量。在兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，該基因表達(dá)量均顯著高于WT（圖3a）；另外，為了檢測SlMYB75基因在各組織中表達(dá)情況，分別取WT 與過表達(dá)SlMYB75株系幼根、嫩莖、幼葉、花（開花當(dāng)天）、綠熟期果實(shí)，通過Trizol 法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過熒光定量檢測過表達(dá)株系中SlMYB75基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)SlMYB75基因在果實(shí)中表達(dá)量較高，在花中表達(dá)量較低（圖3b）。

圖3a SlMYB75 在WT 和過表達(dá)株系中的表達(dá)量（P＜0.01）；圖3 b SlMYB75 基因的組織表達(dá)分析；圖3 c 果實(shí)整體顏色觀察；圖3 d 果實(shí)外果皮顏色觀察；圖3 e 過表達(dá)與WT 果實(shí)解剖觀察；圖3 f 果實(shí)果肉顏色觀察（標(biāo)尺=1 cm）Fig.3a Expression analysis of SlMYB75 in wild type and transgenic lines (P＜0.01)；Fig.3 b Tissue-specific expression profiles of SlMYB75；Fig.3 c Observation of the overall fruit color；Fig.3 d Observation of fruit outer skin color；Fig.3 e Overexpression and WT fruit anatomical observation；Fig.3 f Observation of fruit pulp color(Bars=1 cm)

2.4 過表達(dá)SlMYB75 改變果實(shí)顏色

通過觀察表型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SlMYB75株系與WT 相比，完全成熟果實(shí)顏色發(fā)生明顯變化，解剖并分離果皮、果肉，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系果實(shí)的果皮和果肉顏色均由紅色變?yōu)槌赛S色（圖3c-f）。

2.5 過表達(dá)SlMYB75 對果實(shí)重量以及含糖量影響

通過對果實(shí)重量測量統(tǒng)計(jì)，過表達(dá)株系完全成熟果實(shí)單果平均重量與WT 相比顯著下降（圖4a）。利用果實(shí)糖度計(jì)檢測成熟期轉(zhuǎn)基因與WT 番茄果實(shí)的含糖量，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系與WT 果實(shí)含糖量相比顯著上升，可溶性糖含量提高約18%，且具有顯著性差異（圖4b）。利用硬度計(jì)檢測成熟期轉(zhuǎn)基因與WT 番茄果實(shí)的硬度，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系與WT 果實(shí)硬度相比顯著上升。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系與WT 果實(shí)硬度相比顯著上升，硬度提高約42%，且具有顯著性差異（圖4c）。

圖4(a) SlMYB75 過表達(dá)株系與WT 完全成熟果實(shí)平均重量比較（P＜0.01）；圖4 (b)SlMYB75 過表達(dá)株系與WT 完全成熟果實(shí)平均可溶性糖含量比較（P＜0.01）；圖4 (c)SlMYB75 過表達(dá)株系與WT 完全成熟果實(shí)平均硬度比較（P＜0.01）；Fig.4(a) Average weight comparison between SlMYB75 overexpression lines and the total mature fruit of WT(P＜0.01)；Fig.4 (b)Average soluble sugar content comparison between SMYB75 overexpression lines and the total mature fruit of WT(P＜0.01)；Fig.4 (c)Average firmness comparison between SlMYB75 overexpression strain and WT fully mature fruit(P＜0.01)

2.6 過表達(dá)SlMYB75 使果實(shí)外果皮細(xì)胞變小

通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，相同發(fā)育時(shí)期（完熟期）的過表達(dá)SlMYB75株系果實(shí)外果皮細(xì)胞的平均面積與WT 相比明顯變小，通過掃描電鏡拍照、Image.J 軟件統(tǒng)計(jì)，表皮細(xì)胞面積顯著下降（圖5）。

圖5a WT果實(shí)外果皮細(xì)胞，標(biāo)尺=100 μm；圖5 b,c SlMYB75 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因果實(shí)外果皮細(xì)胞標(biāo)尺=100 μm；圖5d 面積大小統(tǒng)計(jì)（P＜0.01）Fig.5a:Scanning electron micrographs of wild-type fruit exocarp cells,bars=100 μm；Fig.5b-c: SlMYB75 over-expressed transgenic fruit outer rind cells,scanning electron microscope,Bars=100 μm；Fig.5d:picture shows area size statistics.(P＜0.01)

2.7 過表達(dá)SlMYB75 株系種皮顏色與WT 存在明顯差異，種子千粒重沒有變化

將同時(shí)期收取的轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因種子烘干后，通過觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)株系種皮顏色明顯深于WT 種皮。為了檢測種子千粒重是否發(fā)生變化，隨機(jī)挑選OE1、OE2 和WT 種子進(jìn)行測重，結(jié)果顯示：過表達(dá)SlMYB75并沒有使種子千粒重發(fā)生改變（圖6）。

圖6a 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因種子的顏色比較。標(biāo)尺=1 cm；圖6 b 轉(zhuǎn)基因與非轉(zhuǎn)基因烘干后的種子千粒重量化圖；圖6 c,d 轉(zhuǎn)基因與WT 種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)（P＜0.01）Fig.6a:Color comparison between transgenic and non-transgenic seeds.(Bar=1 cm)；Fig.6 b:Thousand seed weight after transgenic and non-transgenic drying；Fig.6 c,d:Germination rate statistics of transgenic and wild-type seeds(P＜0.01).

2.8 過表達(dá)SlMYB75 株系種子萌發(fā)率降低

為了檢測過表達(dá)株系種子萌發(fā)能力，取WT、OE1 與OE2 三個(gè)株系的種子，分別用75%酒精和4%次氯酸鈉徹底消毒后，均勻播種于MS 固體培養(yǎng)基表面，放置于恒溫培養(yǎng)箱（28 ℃）進(jìn)行暗培養(yǎng)，每天觀察拍照并統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖6c,d，圖6(c)為0～4 d 種子萌發(fā)情況，圖6(d)為萌發(fā)率量化統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示：過表達(dá)株系種子萌發(fā)率顯著低于WT，第6 d 時(shí)，WT 種子基本完全萌發(fā)，但轉(zhuǎn)基因兩個(gè)株系種子萌發(fā)率不超過70%，因此，過表達(dá)SlMYB75使種子萌發(fā)率顯著下降。

2.9 過表達(dá)SlMYB75 株系幼苗下胚軸紫色消失

轉(zhuǎn)基因與WT 幼苗下胚軸顏色有明顯差異，WT 子葉下胚軸呈現(xiàn)紫色，而過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系下胚軸沒有紫色物質(zhì)積累，紫色物質(zhì)應(yīng)是花青素，說明過表達(dá)SlMYB75抑制了花青素的合成或積累（圖7）。

圖7 轉(zhuǎn)基因與WT 株系子葉下胚軸對比Fig.7 Comparison of cotyledon hypocotyls between transgenic and WT strains

3 討論

MYB 作為植物轉(zhuǎn)錄因子中最大家族之一，主要參與調(diào)控植物激素的應(yīng)答[18]、植物的非生物脅迫響應(yīng)[19]、調(diào)控植物的形態(tài)建成[20]、調(diào)控植物次生代謝反應(yīng)[21,22]等過程。本文通過組織表達(dá)特異性分析發(fā)現(xiàn)，SlMYB75基因在WT 番茄的根、葉和果實(shí)中表達(dá)量較高，在根和果實(shí)中最高；檢測過表達(dá)株系各組織中SlMYB75的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系植株的根、葉和果實(shí)表達(dá)量升高較顯著，其中果實(shí)中表達(dá)量最高。另外，結(jié)合表達(dá)量(圖3)與種子萌發(fā)率(圖6c,d)發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)量越高種子萌發(fā)率越低。這說明SlMYB75基因可能在番茄種子萌發(fā)以及幼苗和果實(shí)的生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用。

類黃酮物質(zhì)的合成是由一系列轉(zhuǎn)錄因子包括MYB、bHLH和WD重復(fù)蛋白組成的三重復(fù)合物共同調(diào)節(jié)的[23]。目前，已有擬南芥AtMYB75/PAP1的研究報(bào)道，擬南芥中PAP1能夠促進(jìn)愈傷組織中花青苷的合成。在擬南芥中通過RNAi的方法沉默PAP1基因?qū)е掠酌缰谢ㄇ嘬盏姆e累減少，另外，沉默PAP1基因的同源基因PAP2，MYB113和MYB114也會降低花青素的合成[24]。在啤酒花中異源表達(dá)AtPAP1/MYB75會顯著增加啤酒花幼葉和花中花青素的積累[25]。研究表明，在番茄(AC)中過表達(dá)擬南芥At/PAP1/MYB75同源基因SlMYB75，會導(dǎo)致番茄花和果實(shí)等器官中花青素的積累，果實(shí)顏色由紅色變?yōu)樽仙玔26]。孟夏等在中蔬六號中過表達(dá)SlMYB75使果實(shí)顏色由紅色變?yōu)辄S色，且花雄蕊中花青素積累增多。在本文中，在AC過表達(dá)SlMYB75使果實(shí)顏色由紅色變?yōu)辄S色，且幼苗子葉下胚軸中花青素積累減少(圖7)，該表型與之前研究不同。因此，SlMYB75基因在番茄中的功能有待進(jìn)一步研究。

番茄果實(shí)內(nèi)可溶性葡萄糖和果糖的合成是在果實(shí)的發(fā)育和成熟過程中進(jìn)行的，蔗糖濃度在開花后會不斷下降，在果實(shí)成熟期由于轉(zhuǎn)化酶的作用使其持續(xù)保持較低水平[28,29,30]。我們利用糖度計(jì)檢測成熟期轉(zhuǎn)基因與WT 果實(shí)含糖量，結(jié)果顯示（圖4b），WT 番茄含糖量在4.53 g/100 g 鮮重，過表達(dá)SlMYB75轉(zhuǎn)基因株系果實(shí)可溶性糖含量在5.31 g/100 g 鮮重，兩者之間存在顯著性差異。這說明過表達(dá)SlMYB75能夠提高成熟番茄果實(shí)可溶性糖含量。通過種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SlMYB75株系種皮顏色變深（圖6a），幼苗期子葉下胚軸與WT 相比紫色物質(zhì)積累消失（圖7），且種子萌發(fā)率降低（圖6c,d）。這說明SlMYB75能夠影響番茄種子和幼苗的發(fā)育。但是SlMYB75基因影響番茄果實(shí)含糖量以及對種子和幼苗發(fā)育的機(jī)理尚不清楚需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

番茄SlMYB75編碼275 個(gè)氨基酸，該蛋白定位在細(xì)胞核中。過表達(dá)番茄SlMYB75能夠改變成熟番茄果實(shí)顏色和大小，果實(shí)含糖量顯著升高。種皮顏色加深，種子萌發(fā)率下降，且幼苗下胚軸顏色消失。這說明番茄SlMYB75基因能夠在番茄種子、幼苗和果實(shí)中發(fā)揮作用。