碳量子點(diǎn)的抑菌性能研究

趙 艷

(延安大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000)

碳量子點(diǎn)(CQDs)是一種新型的熒光材料，具有良好的光學(xué)性能、生物相容性和低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，受到研究者的廣泛關(guān)注，成為了醫(yī)學(xué)、生物科學(xué)、化學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-3]。碳量子點(diǎn)具有碳骨架結(jié)構(gòu)，通常以分散的形式存在，呈球狀，碳納米顆粒平均粒徑5 nm。除了具有與半導(dǎo)體量子點(diǎn)相似的優(yōu)越熒光性能，這種新型碳納米材料具有反應(yīng)條件簡(jiǎn)單、制得容易、綠色環(huán)保和生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，并可通過化學(xué)修飾的手段實(shí)現(xiàn)功能化，有望在生物和醫(yī)學(xué)檢測(cè)等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)應(yīng)用。為了綠色合成碳量子點(diǎn)，越來越多的廉價(jià)化合物被用作原料，如檸檬酸[4]、抗壞血酸[5]、蛋白質(zhì)[6]、氨基酸[7]等。雜原子摻雜是一種廣泛用作功能化的方法。常見的雜原子有氮、硫、磷、硅等。研究人員對(duì)氮摻雜的碳量子點(diǎn)進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)氮摻雜能夠顯著增強(qiáng)碳量子點(diǎn)的熒光性能，而且能夠有效改善碳量子點(diǎn)的生物相容性。

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在環(huán)境中廣泛存在，且對(duì)環(huán)境變化非常敏感，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能組織與絕大多數(shù)的微生物都很類似，是一種廣泛使用的研究細(xì)胞生物學(xué)和分子的模型生物。此外，大腸桿菌還被廣泛應(yīng)用于研究重金屬[8]、除草劑[9]及納米材料[10]等外源性物質(zhì)的毒性。

本文工作采用抗壞血酸和賴氨酸、抗壞血酸和乙二胺2種原料，在水溶液中制備了2種氮摻雜碳量子點(diǎn)，選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為實(shí)驗(yàn)菌種，用藥敏法進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定了2種氮摻雜碳量子點(diǎn)的抑菌性能，以更直觀的現(xiàn)象觀察氮摻雜碳量子點(diǎn)的抑菌性能。通過本實(shí)驗(yàn)的研究，改變合成材料而改變碳量子點(diǎn)的抑菌性能，降低它對(duì)細(xì)胞的毒性，使其具有很好的生物兼容性，拓寬了碳量子點(diǎn)在生物分析中的應(yīng)用，對(duì)碳量子點(diǎn)在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用有一定的參考價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

LS-55熒光分光光度計(jì)(美國PE)；UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(上海島津國際貿(mào)易有限公司)；MM823LA6-NS美的微波爐(廣東美的微波電器制造有限公司)；YC-330醫(yī)用冷藏箱(青島澳柯瑪超低溫冷凍設(shè)備有限公司)；抑菌劑載體(5 mm直徑圓形定性慢速濾紙片，經(jīng)壓力蒸汽滅菌處理后，置120°烤干2 h，保存?zhèn)溆?；DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；微量移液器(5 mL-50 mL，可調(diào)式)；游標(biāo)卡尺(成都量具刃具總廠)；一次性塑料平板；接種環(huán)；玻璃試管。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(pH 7.2～7.4)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(pH 7.2～7.4)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，0.03 mol/L，pH 7.2)；所以試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水(大于18.2 ΩM·cm)試驗(yàn)菌株為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，均來源于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 碳量子點(diǎn)的合成

分別合成兩種碳量子點(diǎn)(CQDs)：

抗壞血酸和乙二胺為原料合成的CQDsA[11]：稱取0.1862 g抗壞血酸，加入50 mL水溶解于燒杯中，磁力攪拌10 min后，加入5.00 mL乙二胺，置于圓底燒瓶中，于363 K下回流3 h，冷卻至室溫，過濾得到透明的黃色上清液，用水定容至250 mL，其濃度為2.54×10-2mol/L(以碳計(jì))。

抗壞血酸和賴氨酸合成的CQDsB[12]：稱取0.1981 g抗壞血酸和0.1658 g賴氨酸于50 mL燒杯中，加入20 mL超純水充分?jǐn)嚢枞芙夂蠓胖梦⒉t內(nèi)，550W功率下微波2.0 min，無色透明溶液變成淡黃色透明溶液，表明CQDs逐漸形成。為去除大顆粒物質(zhì)，以轉(zhuǎn)速1000 r/min離心10 min，用0.22 μm濾膜純化上清液，透析12 h，取上清液得到CQDs溶液，其濃度為6.75×10-2mol/L(以碳計(jì))。

2 抑菌性實(shí)驗(yàn)

2.1 菌懸液的制備

在潔凈工作臺(tái)上，用接種環(huán)挑取一定量的供試菌株接入試管斜面培養(yǎng)基上。然后置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，將供試菌株活化，再用滅菌的生理鹽水配制濃度為107～108cfu·mL-1的菌懸液，備用。

2.2 抑菌樣片的制備

取定性濾紙，用打孔機(jī)打成5 mm直徑的圓形小紙片，將濾紙片放入清潔干燥的培養(yǎng)皿中，高壓消毒滅菌后，備用。取無菌干燥的直徑為5 mm的定性濾紙片，每片滴加量子點(diǎn)溶液20 mL，然后將濾紙片平放于清潔無菌的平板中，開蓋置于電熱恒溫培養(yǎng)箱(37℃)中烘干，備用。

2.3 空白對(duì)照樣片的制備

取無菌干燥的直徑為5 mm的濾紙片，每片滴加無菌純水20 mL，干燥后備用。

2.4 染菌平板的制備

用接種環(huán)蘸取濃度為107～108cfu·mL-1的試驗(yàn)菌懸液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面上均勻涂抹3次，每次涂抹轉(zhuǎn)動(dòng)平板60°。蓋好平板，置于室溫干燥5 min。

2.5 量子點(diǎn)的抑菌活性測(cè)定

在無菌潔凈工作臺(tái)上，用無菌鑷子取抑菌樣片貼放染菌平板表面，每個(gè)平板放3片試驗(yàn)樣片，1片空白對(duì)照，共計(jì)4片。貼好以后，用無菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，將平板倒置在37℃的生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察紙片周圍有無抑菌圈，并測(cè)量抑菌圈的直徑，以抑菌圈直徑d大小進(jìn)行判斷(d≤7 mm表示無抑菌作用；7 mm

3 結(jié)果與討論

3.1 紫外光譜

將CQDsA用水稀釋1000倍后得到2.54×10-5mol/L的CQDs溶液測(cè)定其吸收光譜如圖1(曲線1)。CQDsA在波長(zhǎng)220～350 nm的紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，吸收峰位于262 nm處。

1.CQDsA 2.CQDsB

將CQDsB用水稀釋1000倍后得到6.75×10-5mol/L的CQDs溶液測(cè)定其吸收光譜如圖1(曲線2)。CQDsB在265 nm處有特征吸收峰，這與芳香族碳?xì)浠衔镏笑墟I構(gòu)型、碳碳雙鍵的π-π*躍遷及擴(kuò)展共軛效應(yīng)密切相關(guān)[14]。2種CQDs的紫外吸收光譜與文獻(xiàn)報(bào)道方法[15]吻合，CQDs在可見光區(qū)域都沒有明顯吸收，但在紫外區(qū)域有顯著的吸收。掃描波長(zhǎng)越短，吸收強(qiáng)度越大，是CQDs的典型吸收光譜。圖譜光滑無雜峰。由于量子點(diǎn)在可見區(qū)沒有特征吸收峰，故限制了其應(yīng)用范圍。

3.2 熒光光譜圖

CQDs是一種在水溶液中可以發(fā)出很強(qiáng)熒光的納米材料。CQDsA是以乙二胺作為氮源制備的碳量子點(diǎn)，不同激發(fā)光下的發(fā)射光譜如圖2所示。從圖2可以看出，不同激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)CQDs的熒光位置和強(qiáng)度有較大影響。在激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm時(shí)，對(duì)應(yīng)的最大發(fā)射峰在431 nm處。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)由360 nm增加到395 nm時(shí)，發(fā)射光譜的位置由431 nm紅移到460 nm。隨著激發(fā)波長(zhǎng)不斷變化熒光發(fā)射峰也在不斷變化，熒光強(qiáng)度不斷降低，波長(zhǎng)發(fā)生紅移。

λex(1-6):320,340,350,360,370,380 nm

CQDsB是以賴氨酸作為氮源制備的碳量子點(diǎn)。其熒光發(fā)射譜圖如圖3所示。從圖3可以看出，在340 nm處，對(duì)應(yīng)的最大發(fā)射峰在422 nm處。在激發(fā)波長(zhǎng)340 nm前，CQDs的熒光強(qiáng)度不斷增強(qiáng)且位置發(fā)生紅移，在激發(fā)波長(zhǎng)340 nm后，熒光強(qiáng)度不斷下降且發(fā)射波長(zhǎng)位置發(fā)生紅移現(xiàn)象。

λex(1-6):320,340,350,360,370,380 nm

從圖2、圖3可以看出，氮摻雜的碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度大幅度增強(qiáng)，這是由于合成過程中保留了大部分的羧基，為氮摻雜提供大量的活性位點(diǎn)，使得氮摻雜碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度大幅增加。碳量子點(diǎn)的熒光發(fā)射波長(zhǎng)對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)有一定的依賴性，這種現(xiàn)象可能是由于CQDs表面的缺陷、粒徑尺寸不同、發(fā)射空腔和位置不同，導(dǎo)致了多能級(jí)的產(chǎn)生，從而使CQDs的發(fā)射光譜對(duì)激發(fā)光具有依賴性[16]。這種現(xiàn)象在CQDs領(lǐng)域普遍存在。

3.3 量子點(diǎn)的抑菌活性測(cè)定結(jié)果

2種碳量子點(diǎn)的抑菌性能如表1所示?？梢钥闯鯟QDsA對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯的抑菌作用，CQDsA的濃度為2.54×10-2mol/L時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌高度敏感，對(duì)大腸桿菌中度敏感；CQDsB的濃度為6.75×10-2mol/L時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無抑菌作用。

表1 量子點(diǎn)的抑菌圈大小

注：“-”代表無抑菌圈，“+”代表有抑菌圈

圖4A、B分別為CQDsA對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果圖，圖4C、D分別為CQDsB對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果圖。從圖4可以看出CQDsA對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于大腸桿菌。結(jié)合抑菌圈大小，說明CQDsA對(duì)金黃色葡萄球菌高度敏感，對(duì)大腸桿菌中度敏感。CQDsB對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無抑菌作用，圖中可看出CQDsB對(duì)這2種細(xì)菌無抑菌圈產(chǎn)生，也從側(cè)面說明CQDsB對(duì)細(xì)胞無毒性，或者說生物毒性很低。

1，2，3為抑菌樣片，4為空白對(duì)照樣片。

通過以上實(shí)驗(yàn)可以看出，CQDsA對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑菌作用，這是因?yàn)镃QDsA是氮摻雜的碳量子點(diǎn)(N-CQDs)，N-CQDs表面有氨基的存在，氨基與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合，破壞細(xì)胞壁的完整性，阻止代謝產(chǎn)物以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)正常穿過細(xì)胞膜，使細(xì)菌失去營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致生長(zhǎng)停滯，最終細(xì)胞凋亡[17]。CQDsB是以賴氨酸為原料經(jīng)微波合成，賴氨酸是一種人體必需氨基酸，是控制人體生長(zhǎng)的重要物質(zhì)抑長(zhǎng)素中最重要的成份，對(duì)人的中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)都有著重要作用。合成的CQDsB生物毒性低，有很好的生物相容性，故對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌無抑菌作用。

3.4 不同濃度碳量子點(diǎn)對(duì)供試菌的抑菌效果

因?yàn)镃QDsB對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均無抑菌作用，圖4實(shí)驗(yàn)中CQDs的濃度已高達(dá)1000 mg/L，說明CQDsB無細(xì)胞毒性，故不再進(jìn)行研究。以下主要探討CQDsA對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。探討了濃度分別為6 mg/L、12 mg/L、24 mg/L、48 mg/L、240 mg/L、480 mg/L的CQDsA溶液對(duì)供試菌的抑菌效果，結(jié)果見表2。從表中可以看出當(dāng)CQDsA濃度達(dá)到480 mg/L時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯的抑菌作用，當(dāng)CQDsA濃度為48 mg/L時(shí)，量子點(diǎn)對(duì)大腸桿菌無抑菌作用，當(dāng)CQDsA濃度為24 mg/L時(shí)，量子點(diǎn)對(duì)兩種細(xì)菌均無抑菌作用，說明CQDsA對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用強(qiáng)于大腸桿菌，這可能與細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有關(guān)。金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁含大量的肽聚糖和磷壁酸，磷壁酸所帶的負(fù)電荷能與碳量子點(diǎn)上游離的氨基結(jié)合，從而干擾細(xì)胞膜上部分高活性合成酶的合成，影響細(xì)胞正常代謝活動(dòng)，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，達(dá)到抑菌作用。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁最外層是一層較厚的類脂多糖物質(zhì)，它能吸附質(zhì)子化的碳量子點(diǎn)形成聚合物，破壞類脂多糖的結(jié)構(gòu)，擾亂細(xì)菌新陳代謝，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。由于合成過程中質(zhì)子化的碳量子點(diǎn)較少，對(duì)細(xì)胞壁破壞能力弱，故抑菌作用較弱。

表2 不同濃度碳量子點(diǎn)溶液的抑菌試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

4 結(jié)論

本文采用2種方法合成了具有高熒光強(qiáng)度的CQDs，通過對(duì)2種革蘭氏細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)，初步鑒定了CQDs的抑菌性能。CQDsA用乙二胺作鈍化劑進(jìn)行表面改性，N原子和C原子半徑相近，作為電子供體對(duì)CQDs進(jìn)行修飾，得到的氮修飾的CQDs表現(xiàn)出更優(yōu)異的光學(xué)性能。這些氮原子改變了CQDs的電子分布，故改變了CQDs的性質(zhì)。此CQDs對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有很強(qiáng)的抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果強(qiáng)于大腸桿菌。CQDsB對(duì)2種細(xì)菌都無抑菌作用。選擇不同合成材料，可以有效的降低碳量子點(diǎn)的生物毒性，使其更好地應(yīng)用于細(xì)胞成像、生物醫(yī)學(xué)開發(fā)和利用。