武夷巖茶香氣相關(guān)酶基因表達(dá)差異分析

武廣珩，謝其婷，呂橄，林志鑾,，王飛權(quán)，任宇紅，張傳海*

(1 福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 武夷山 354300；2 武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院，福建 武夷山 354300；3 中國(guó)烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 武夷山 354300；4 華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院/生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237)

我國(guó)的飲茶歷史很長(zhǎng)，產(chǎn)于福建省北部、武夷山地區(qū)的武夷巖茶，香高馥郁、滋味醇厚滑潤(rùn)，屬于半發(fā)酵的青茶，是閩北烏龍茶的代表、中國(guó)十大名茶之一，也是烏龍茶的始祖[1]。武夷巖茶亦是所有茶類(lèi)中工序最多、最復(fù)雜的茶類(lèi)，一般制作工序?yàn)椋翰烧?、萎凋、做?發(fā)酵)、殺青、揉捻、烘干、挑揀、毛茶、初焙(走水)、退火、復(fù)焙、成茶(精茶)[2]。水仙和肉桂是武夷巖茶產(chǎn)區(qū)中的2個(gè)主要品種[3]。肉桂茶的香氣猶如桂皮，茶湯色彩橙黃清澈，回甘醇厚濃郁；水仙茶湯有淡淡的花果香味，顏色比較清澈透亮[4]。瑞香屬于中生高香品種，是從黃旦雜交后代中選育而來(lái)，茶湯香氣馥郁高揚(yáng)，花果香較母本更為顯著，最大的特色是滋味不苦不澀且甘潤(rùn)醇厚[5-6]。

茶葉的加工過(guò)程中，影響茶葉香氣的幾種重要酶類(lèi)有：β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase，BG)、β-櫻草糖苷酶(beta-primroseglucosidase，BP)、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Ascorbate peroxidase，APX)。鄧慧莉等[7]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)香氣的前體是以β-葡萄糖苷的形式而存在的，而β-葡萄糖苷酶促使這些香氣前體的釋放。陳壽松等[8]發(fā)現(xiàn)β-櫻草糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的基因相對(duì)表達(dá)量與香氣前體物質(zhì)的物質(zhì)總量及糖苷類(lèi)成分的變化成正相關(guān)性。多酚氧化酶是決定茶葉品質(zhì)的重要酶類(lèi)之一，它不僅影響茶樹(shù)的生理代謝，也影響著制作成茶的過(guò)程中多酚類(lèi)物質(zhì)的氧化程度，紅茶中的茶紅素和茶黃素是通過(guò)多酚氧化酶的酶促作用形成[9]?？箟难徇^(guò)氧化物酶是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，又是維生素C代謝的主要酶類(lèi)，在福鼎大白茶在萎凋的過(guò)程中，APX基因的表達(dá)量隨著萎凋時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出“升高—降低—再升高—再降低”的變化特點(diǎn)[10]。

影響茶葉品質(zhì)的內(nèi)因有茶葉品種本身的內(nèi)含物、加工過(guò)程中的酶活性變化和酶基因的表達(dá)差異等；外因有溫度、濕度、光照、土壤、茶葉的采制技術(shù)等。本論文通過(guò)研究武夷巖茶主打品種肉桂、水仙、瑞香鮮葉香氣相關(guān)酶基因的表達(dá)差異，對(duì)影響茶品質(zhì)內(nèi)因方面展開(kāi)探討，為加工品質(zhì)更優(yōu)的茶葉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年4月20日—5月15日，武夷學(xué)院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃的肉桂、水仙、瑞香新鮮嫩芽葉片。采摘標(biāo)準(zhǔn)：一芽二葉，采樣后用液氮預(yù)冷處理。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

采用Eastep Super總RNA提取試劑盒(Promega)提取肉桂、水仙、瑞香新鮮嫩芽葉片總RNA，用微量核酸檢測(cè)儀(Eppendorf BioPhotometer Plus)檢測(cè)RNA樣品質(zhì)量和濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其清晰度與完整性，保存于-80 ℃冰箱(SANYO MDF-682)備用。采用GoScriptTMReverse Transcription Mix(Promega)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將已經(jīng)提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。具體使用步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)。

1.2.2 基因克隆及序列分析

根據(jù)NCBI已登錄的過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶序列(登錄號(hào)：JQ740734.1和AY659975.1)，分別設(shè)計(jì)過(guò)氧化物酶基因(CsAPX)和多酚氧化酶基因(CsPPO)的引物(表1)。PCR反應(yīng)采用25 μL體系：TaKaRa Ex Taq PCR反應(yīng)體系；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s；按52 ℃退火40 s；72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min；產(chǎn)物4 ℃保存。所有的PCR產(chǎn)物均用1%凝膠電泳，然后將目標(biāo)片段的PCR產(chǎn)物按照UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(上海生工)回收目的基因條帶，并委托上海生工進(jìn)行序列測(cè)定。

表1 用于克隆茶樹(shù)過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶基因cDNA片段的引物序列Tab.1 Primer cDNA pairs for amplifying polyphenol oxidase and peroxidase genes

1.2.3 熒光定量PCR分析

使用實(shí)時(shí)定量PCR儀(Bio-rad Connect 96)進(jìn)行擴(kuò)增，SYBR Green試劑盒為SuperReal PreMix Plus(TIANGEN)，反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性90 s，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。以茶樹(shù)18S rRNA為內(nèi)參，根據(jù)1.2.2得到的香氣相關(guān)酶CsAPX和CsPPO基因序列設(shè)計(jì)引物和已經(jīng)報(bào)道的CsBG1、CsBP及18S rRNA基因引物序列進(jìn)行表達(dá)量分析[11]，見(jiàn)表2。

表2 用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物序列Tab.2 Primer sequences of Real-time PCR

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列檢索比對(duì)?；虻南鄬?duì)表達(dá)量，使用Excel 2007和One-way ANOVO對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉總RNA的提取

用肉桂、水仙、瑞香3個(gè)樣品的新鮮葉片提取總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠快速電泳檢測(cè)。從圖1中可知，3個(gè)樣品肉桂、水仙、瑞香總RNA電泳圖譜帶型清晰、條帶完整，有3個(gè)條帶，提取結(jié)果較為理想。經(jīng)RNA濃度測(cè)定后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CsAPX和CsPPO基因的擴(kuò)增

為了擴(kuò)增武夷巖茶中過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶的目的基因，選取其中的水仙、肉桂和瑞香的cDNA為模板，進(jìn)行了基因片段的PCR擴(kuò)增，并獲得對(duì)應(yīng)的條帶(圖2)。PCR所需引物(表1)根據(jù)NCBI已登錄的過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶序列(登錄號(hào)：JQ740734.1和AY659975.1)設(shè)計(jì)。測(cè)序發(fā)現(xiàn)，3個(gè)品種的CsAPX基因編碼431個(gè)氨基酸，CsPPO基因編碼575個(gè)氨基酸；CDS序列間僅存在個(gè)別的SNP差異。

M—DL2000 DNA標(biāo)記；1—瑞香；2—水仙；3—肉桂。圖1 茶樹(shù)總RNA的電泳圖Fig.1 Total RNA extraction of tea plant

A—CsAPX PCR擴(kuò)增；B—CsPPO PCR擴(kuò)增；M—DNA標(biāo)記；1—水仙；2—肉桂；3—瑞香。圖2 克隆茶樹(shù)過(guò)氧化物酶和多酚氧化酶基因片段Fig.2 PCR amplification of polyphenol oxidase and peroxidase gene from tea plant

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量分析

為了明確實(shí)驗(yàn)中4對(duì)基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物的可靠性，以水仙的cDNA作為模板進(jìn)行了PCR檢測(cè)。從圖3可看出，第2～5泳道4條明亮程度和大小不一的擴(kuò)增條帶。之后，以肉桂、水仙、瑞香3個(gè)樣品的cDNA為模板，以表2中的序列為引物，進(jìn)行qPCR。結(jié)果表明，品種水仙和瑞香的鮮葉中CsPPO基因的表達(dá)量很低，肉桂中的表達(dá)量比18S rRNA低，但顯著高于水仙和瑞香(圖4 A)；肉桂鮮葉中幾乎不表達(dá)CsBP基因，但水仙與瑞香中均有表達(dá)，且水仙中的表達(dá)量要明顯多于瑞香(圖4B)；肉桂、水仙、瑞香中都有CsBG1的表達(dá)，但瑞香中的表達(dá)最多，水仙次之，肉桂最少(圖4C)；CsAPX在3個(gè)茶葉品種中也都有表達(dá)，且肉桂和水仙中的表達(dá)量相當(dāng)，瑞香較少(圖4D)。

M—DL2000 DNA標(biāo)記；1—rt-Cs18S；2—rt-CsAPX；3—rt-CsBG1；4—rt-CsBP；5—rt-CsPPO。圖3 茶樹(shù)中基因表達(dá)引物的檢測(cè)Fig.3 Detection of primers for gene expression in tea plants

不同的字母代表顯著性差異(P<0.01，one way ANOVA)。圖4 不同茶樹(shù)鮮葉中香氣相關(guān)酶的基因表達(dá)模式分析Fig.4 Real-time analysis of expression levels of aroma related genes

3 結(jié)論與討論

研究[12]表明，在綠茶的加工過(guò)程中，由于多酚氧化酶的活力略有上升，使得兒茶素被氧化，減輕了兒茶素的苦澀味；兒茶素氧化過(guò)程中產(chǎn)生的鄰醌與蛋白質(zhì)分解后的氨基酸作用后形成甜香味。本研究中，肉桂鮮葉中CsPPO的表達(dá)量明顯高于水仙和瑞香，所以肉桂沖泡的茶湯會(huì)比水仙和瑞香的茶湯更加濃郁，回甘更加醇厚。

β-櫻草糖苷酶對(duì)于茶葉而言，其主要作用是通過(guò)水解萜醇類(lèi)糖苷香氣前體，使茶葉呈現(xiàn)出天然花香[7]。CsBP在水仙鮮葉中的表達(dá)量比瑞香更多，但二者都顯著高于肉桂，故水仙沖泡的茶湯中天然花香最為濃郁，瑞香次之。

在茶葉的加工過(guò)程中，β-葡萄糖苷酶可以促進(jìn)糖苷類(lèi)香氣前體的水解并釋放出揮發(fā)性糖苷，為茶葉香氣成分的積累提供物質(zhì)基礎(chǔ)，從而可增加茶葉的香氣[13]。結(jié)果顯示肉桂、水仙、瑞香中都有CsBG的表達(dá)，但瑞香中的含量最多，故而瑞香茶湯的茶香味更濃。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)在紅茶加工中，可以將某些黃烷醇類(lèi)物質(zhì)經(jīng)過(guò)氧化作用形成茶黃素，而茶黃素又能迅速經(jīng)氧化聚合作用形成復(fù)雜的茶紅素類(lèi)物質(zhì)，茶紅素在成品茶的褐色方面起到了重要的作用[14]。CsAPX基因的表達(dá)在3個(gè)品種中都有存在，且肉桂和水仙中的表達(dá)量相當(dāng)，但瑞香中的含量相比之下較少。因此，在茶湯色澤方面，相同的焙火條件，肉桂和水仙的顏色較瑞香會(huì)更深；同時(shí)由于肉桂鮮葉中CsPPO的表達(dá)量明顯高于水仙，所以在CsAPX和CsPPO基因的雙重作用下，肉桂茶湯最深，水仙次之。

綜上所述，本研究的結(jié)論與人們?nèi)粘Ｔ跊_泡相同加工工藝、相同品牌的肉桂、水仙、瑞香所產(chǎn)生的認(rèn)知一致，為今后選擇茶葉鮮葉用于后期加工提供了理論支持。