葉酸靶向載MMP-2反義寡核苷酸磁性納米復合物在喉癌細胞中的分布及靶向性研究*

黃水仙 許熠銘 朱瑾 謝民強 李勇 管明 伏曉

隨著細胞生物學技術的發(fā)展，腫瘤的基因治療在臨床得到廣泛應用?；蛑委煹脑硎遣捎没蜣D移技術將正常目的基因?qū)氚屑毎?，使其表達特定的蛋白質(zhì)。磁性納米顆粒可將基因治療分子攜入細胞并釋放，實現(xiàn)安全有效的靶向性基因治療作用，并可縮短轉染時間、提高轉染效率，而且磁性納米載體有被動靶向、磁靶向和分子靶向等靶向性能，在腫瘤靶向治療方面有一定優(yōu)勢。本研究將MMP-2-ASODN與醛基化海藻酸鈉（ALG）改性的葉酸靶向磁性納米載體耦聯(lián)，制備葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復合物。然后以喉癌Hep-2細胞株及其BALB/c裸鼠皮下移植瘤作為相應模型，采用透射電鏡、普魯士藍鐵染色及MRI成像技術檢測MMP-2-ASODN磁性納米復合物對喉癌細胞的體內(nèi)、外靶向性，為后續(xù)喉癌基因靶向治療打下前期實驗基礎。

資料與方法

1主要藥物、試劑與儀器

葉酸（美國Sigma公司），ALG（山東青島水產(chǎn)有限公司）。RCT bssic磁力攪拌器（德國IKA公司），DDS-11A數(shù)顯電導率儀（上海雷磁新涇儀器公司），日本電子株式會社提供的透射電子顯微鏡（型號JEM-100CX II），美國Varian公司提供的石墨爐（型號GFA-Ex7i）及鐵空心陰極燈，美國GE公司提供的超導型雙梯度磁共振成像儀（型號GE 1.5 T），1英寸手指線圈。人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2（中南大學湘雅醫(yī)學院細胞庫），BALB/c裸鼠（南方醫(yī)科大學實驗動物中心）。

2 實驗方法

2.1 葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復合物的制備

2.1.1 MMP-2-ASODN的設計和合成

利用Primer5.0軟件，根據(jù)人MMP-2基因cDNA序列設計與啟動子互補的反義寡核苷酸序列（antisenes oligodeoxynucleotide，ASODN），經(jīng) Genbank 同源性檢測證實該ASODN僅與MMP-2基因相應位點匹配，與其它人類基因無匹配。同時設計與其堿基組成相同，但堿基順序隨機排列的無義寡核苷酸序列（nonsense oligodeoxynucleotide，NSODN）作為對照，經(jīng)Genbank檢測與任何已知人類基因無匹配。ASODN和無義寡核苷酸序列的堿基采用硫代修飾以增強穩(wěn)定性，5’端用氨基修飾以便下面實驗連接磁性納米粒子。反義寡核苷酸和無義寡核苷酸均由上海生工公司合成，雙蒸水稀釋至100μmol·L-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

寡核苷酸序列如下：

MMP-2 ASODN：5'-CAC ACC TTG CCA TCG-3'

MMP-2 NSODN：5'-CGT CCC TAT ACG ACC-3'

2.1.2 制備葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復合物

我們課題組前期已成功制備了醛基化ALG修飾的磁性納米粒子，流體力學直徑為48.7±1.7nm，Zeta電位：-66.43±1.22mv，磁核平均粒徑8.116±0.24nm，其最大飽和磁化強度為56.2emu·g-1，矯頑力為零，其磁強度及超順磁性均較好。根據(jù)文獻報道的方法[1，2]合成 NH2-PEG-FA。取 100μL 醛基化ALG修飾的磁性納米顆粒，然后加入30μL葉酸修飾的氨基聚乙二醇溶液（12mg·300μL-1） 和 20μL 100μmol·L-1的 Hpa AS-ODN，渦旋均勻后，于 4℃條件下避光反應24小時。然后再加入一定量的硼氫化鈉溶液，使體系中硼氫化鈉的濃度為0.5mol·L-1。

2.2 葉酸含量的測定

葉酸分子包含高度共軌的苯環(huán)結構，在365nm處存在特征性的強吸收峰，因此利用這個特點可采用紫外分光光度計測量樣品中的葉酸含量[2]。

2.3 納米復合物體外靶向性實驗

2.3.1 細胞鐵染色

選取培養(yǎng)較好的兩組Hep-2細胞，其中一組預先葉酸封閉，經(jīng)消化離心后將其制成單細胞懸液（采用無葉酸RPMI-1640全培養(yǎng)基），調(diào)整其濃度至2×104個·ml-1后分別接種于 24 孔板內(nèi)，500μl/孔。貼壁培養(yǎng)24h，每株細胞各取6孔加入50ul葉酸PBS溶液（孔內(nèi)游離葉酸終濃度1mmol·L-1），作用30分鐘。加入無葉酸RPMI-1640稀釋的納米藥物培養(yǎng)2h，按鐵含量計藥物終濃度依次為0，2.5，5，10，20μg·ml-1。使用 PBS 液充分洗滌殘留藥物粒子，4%多聚甲醛溶液室溫下固定10分鐘。采用普魯士藍液染色，室溫靜置30min并避光，使用雙蒸水洗滌后采用中性紅染液復染。倒置顯微鏡下觀察。

2.3.2 透射電鏡觀察

選取培養(yǎng)較好的兩組Hep-2細胞，其中一組預先葉酸封閉，經(jīng)消化離心后將其制成單細胞懸液（采用無葉酸RPMI-1640全培養(yǎng)基），調(diào)整其濃度至5×104個·ml-1分別接種于 6 孔板內(nèi)，2ml/孔；貼壁培養(yǎng)24h后，加入無葉酸RPMI-1640稀釋的納米藥物培養(yǎng)2h，按鐵含量計藥物終濃度依次為0、2.5、5、10、20μg·ml-1；使用 PBS 液充分洗滌殘留藥物粒子；將胰蛋白酶加入各孔并在消化后制成單細胞懸液，1500rpm離心5分鐘后收集底部沉淀的細胞塊，向其中加入2.5%戊二醛下固定（溫度4℃）；低速離心除去固定液并用1%餓酸固定，采用梯度丙酮進行脫水，使用環(huán)氧樹脂包埋。取超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，觀察細胞吞噬納米藥物在透射電鏡下的情況（中山大學北校區(qū)電鏡室）。

2.4 MRI觀察裸鼠移植瘤內(nèi)納米復合物的分布

2.4.1 喉癌移植瘤動物模型的建立

選取5周齡BALB/c裸鼠6只，在SPF環(huán)境下（中山大學實驗動物中心動物實驗部，場地合格許可證號SYXK粵2007-0081）經(jīng)適應性飼養(yǎng)1周后，將對數(shù)生長期的人喉癌Hep-2細胞以5×107個·ml-1的密度分別接種于裸鼠腋后背部皮下，每只接種0.2ml。

2.4.2 MRI及透射電鏡觀察納米復合物在裸鼠移植瘤內(nèi)的分布

接種Hep-2細胞的裸鼠移植瘤長至直徑10mm左右后進行MRI觀察。裸鼠以1%戊巴比妥鈉經(jīng)腹腔注射麻醉以減少成像過程中的肢體活動。首先進行MR T2加權成像（T2 W1），然后經(jīng)尾經(jīng)脈注射葉酸修飾的納米藥物0.2ml，繼續(xù)飼養(yǎng)2小時后再次行MR成像。

MRI采用Philips Quasar Dual 3.0T MR Achieva磁共振儀完成，選擇頭部線圈，成像系數(shù)TR/TE 1900/62ms，矩陣 512×512，F(xiàn)OV115mm，層厚 1mm，層距0.5mm。

MRI檢查結束后裸鼠脫頸處死，迅速取出瘤塊，1%餓酸固定，采用梯度丙酮進行脫水，使用環(huán)氧樹脂包埋。取超薄切片，枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，觀察細胞吞噬納米藥物在透射電鏡下的情況（中山大學北校區(qū)電鏡室）。

3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 葉酸含量的測定結果

以葉酸含量濃度（μg·ml-1）為縱坐標，吸光度（OD值）為橫坐標，繪制葉酸含量標準曲線（見圖1）。其回歸方程式為y（葉酸含量）=112.08x-0.3832，R2=0.9996。根據(jù)樣品OD值用回歸方程式計算其葉酸含量，實驗重復 3 次，計算均值為 930.5±8.57μg·ml-1。

圖1 葉酸含量標準曲線

2 納米復合物體外靶向性實驗結果

2.1 鐵染色結果

鐵染色結果顯示，納米復合物與Hep-2細胞培養(yǎng)2h后，大量的納米顆粒被Hep-2細胞胞漿吞噬（圖片上顯示為藍色顆粒），并且納米復合物濃度越高，被吞噬的顆粒越多（見圖2a、b）。而在預先給予葉酸封閉后，Hep-2細胞吞噬的納米顆粒較相同濃度下未封閉時明顯減少（圖2c、d）。

圖2a、2b 鐵染色結果顯示Hep-2細胞胞漿內(nèi)吞噬了大量的納米顆粒（藍色顆粒），并且隨著納米藥物濃度增加，吞噬的顆粒越多（圖 2a、b，400×）。圖2c、2d 鐵染色結果顯示預先給予葉酸封閉后，Hep-2細胞吞噬的納米顆粒較相同濃度下未封閉時明顯減少（圖2c、d，200×）。

2.2 透射電鏡觀察

兩組Hep-2細胞與納米復合物共培養(yǎng)2小時后進行透射電鏡檢測，結果見未經(jīng)葉酸封閉處理的Hep-2細胞吞噬大量高電子密度的納米顆粒，成團散布在細胞胞漿內(nèi)（圖3箭頭表示）。而經(jīng)葉酸封閉處理的Hep-2細胞僅吞噬少量高電子密度的納米顆粒。

2.3 荷瘤裸鼠的MR成像結果

BALB/c裸鼠皮下種植Hep-2細胞成瘤后，在經(jīng)尾靜脈注射葉酸靶向磁性納米復合物前和注射24小時后進行MRI成像，結果如圖4所示，注射后瘤區(qū)T2信號顯著降低。

圖3 透射電鏡照片（11.5千倍）

圖4 荷瘤裸鼠的MRI成像結果（左為注射納米藥物前，右為注射后）

2.4 裸鼠移植瘤透射電鏡檢查結果

檢查結果顯示大量高電子密度的納米顆粒被部分腫瘤細胞吞噬，并成團分布于細胞胞漿內(nèi)；另有少量納米顆粒存于細胞間隙（圖5箭頭表示）。

圖5 透射電鏡照片（15.5千倍）

討論

基因治療的原理是采用基因轉移技術將正常目的基因?qū)氚屑毎?，使其表達特定的蛋白質(zhì)。其中，ASODN技術是指利用人工合成的與DNA或mRNA某一區(qū)段互補的ASODN片斷，通過堿基互補原則結合于目的基因上，從而封閉基因的表達，起到基因治療的作用[3]。然而寡核苷酸因其自身負電荷導致較難穿過細胞膜，且易被核酸酶降解[4，5]，因此ASODN需要一個基因載體來維護并提高其轉染效率。目前常用的基因載體主要有病毒、非病毒載體[5，6]。病毒載體主要有慢病毒、腺病毒載體、反轉錄病毒等。病毒轉染效率較高，但仍存有不足之處：病毒載體制備復雜；具有免疫原性及細胞毒性；攜帶DNA量少（4.5～30kbp）；其宿主范圍較為廣泛，同時組織細胞特異性也較為缺乏；潛在的致瘤性會導致在重組過程中產(chǎn)生病毒感染[7]。非病毒載體目前應用最多的是脂質(zhì)體，但是脂質(zhì)體容易被細胞內(nèi)外的水解酶消化、轉染效率不高、組織特異性缺乏、有一定細胞毒性等[8]。不論是病毒載體還是脂質(zhì)體，它們在腫瘤基因治療中靶向性均不良，而基因載體在靶部位聚集較慢、靶部位載體濃度過低是導致基因傳輸及表達效率不高的主要原因[9]。

磁性納米顆粒是一種新型非病毒基因載體，在腫瘤靶向治療方面有一定優(yōu)勢。研究表明在細胞的吞噬作用下直徑在100nm以下的磁性納米顆?？蓴y帶基因治療分子進入細胞并釋放，其靶向性基因治療安全有效[10]。磁性納米顆粒對腫瘤的靶向性主要有分子靶向、磁靶向、被動靶向。腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細胞排列不整齊且間隙較大、缺乏有效的淋巴引流系統(tǒng)形成被動靶向，納米顆粒通過滲透增強和截留作用（enhanced permeability and retention effect，EPRE)更容易沉積在腫瘤組織中[11，12]。通過在外磁場的引導下使磁性納米顆粒逐漸定向于腫瘤為磁靶向機制，使與磁性納米藥物搭載的治療基因在腫瘤區(qū)域定位并集中釋放，達到低毒、高效治療的效果。研究表明，采用磁性納米藥物作為基因載體轉染特定細胞或組織器官，可降低轉染時間，轉染率隨之升高[13]。分子靶向是通過在納米藥物表面修飾針對腫瘤細胞特異靶點的配體（例如單克隆抗體或某些小分子），通過配體-受體的特異性結合使得納米藥物被腫瘤細胞攝取吞噬，從而達到靶向治療的目的。此外，磁性納米載體還具有無免疫原性、無遺傳毒性與細胞毒性等優(yōu)點。

文獻顯示葉酸受體在正常組織中很少表達，而在多種腫瘤組織中過度表達，是一種腫瘤相關抗原[14，15]。我們前面的實驗也證實了葉酸受體在喉癌中高度表達。因此，我們在本實驗中采用葉酸受體作為磁性納米復合物主動靶向的靶點，通過在磁性納米載體表面修飾葉酸，制備葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復合物。我們制備的納米復合物粒徑較小、含有親水的改性表層，可有效的逃避網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬，延長其體內(nèi)循環(huán)時間，增加磁性納米復合物的靶向效率。因此，這種葉酸靶向磁性納米粒作為基因載體具有良好的穩(wěn)定性和靶向性。

由于本納米復合物以Fe3O4作為核心，因此實驗中我們采用鐵染色、MRI、透射電鏡等容易顯示鐵粒子的方法來檢測該葉酸靶向磁性納米復合物的分子靶向性能。鐵染色的原理是Fe3+在酸性條件下與亞鐵氰化鉀通過普魯士藍反應生成藍色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含鐵的部位，可反映組織細胞內(nèi)攝取的氧化鐵納米粒子的情況[16，17]。我們將不同濃度的葉酸靶向納米復合物與Hep-2細胞共培養(yǎng)2h后進行鐵染色檢查，結果發(fā)現(xiàn)Hep-2細胞內(nèi)吞噬了大量的納米顆粒，其吞噬數(shù)量與藥物濃度正相關，而預先給予葉酸封閉的Hep-2細胞同樣吞噬了部分納米顆粒，但是較之相同濃度下未封閉的Hep-2細胞顯著減少。這說明葉酸靶向納米復合物是通過葉酸受體途徑的分子主動靶向作用，可以顯著增加喉癌Hep-2細胞對納米復合物的吞噬。透射電鏡的觀察也可明顯看到Hep-2細胞對納米復合物的吞噬。核磁共振成像（MRI）通過計算機將生物體不同組織在外磁場的作用下產(chǎn)生的共振信號還原為圖像，能夠立體的顯示不同組織間的細小差別，是臨床早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤的重要方法之一。超順磁性納米顆粒（superparamagnetic nanopatticles）是應用于MRI的新一代磁性造影劑。其磁化強度隨磁矩值不同而改變，并且撤去外磁場后其磁化消失，其馳豫率（Relaxivity）顯著高于釓螯合物類造影劑[18，19]。我們制備的葉酸靶向磁性納米復合物具有超順磁性，因此可以作為MRI造影劑。通過MRI檢查可以發(fā)現(xiàn)注射后裸鼠移植瘤區(qū)域T2信號顯著降低，說明經(jīng)尾靜脈注射的葉酸靶向納米復合物具有良好的靶向性，同時具有MR陰性造影劑的效果，可以通過MRI檢查進行藥物分布的檢測。

本研究成功制備了葉酸靶向載MMP-2-ASODN磁性納米復合物，通過鐵染色、MRI、透射電鏡等檢查證實，該納米復合物對喉癌Hep-2細胞和裸鼠移植瘤具有良好的分子靶向性，為后續(xù)喉癌的基因治療奠定了基礎。