云芝糖肽對氧化偶氮甲烷-葡聚糖硫酸鈉誘導小鼠結(jié)直腸癌模型中相關(guān)腸道菌的影響及潛在意義

韓達，王玉成，馮慧琴，程樂樂，楊曉彤

1. 上海師范大學, 上海 200234； 2. 上海芝草生物技術(shù)有限公司, 上海 200233

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種常見的腸道惡性腫瘤。世界范圍內(nèi)，CRC的發(fā)病率和病死率在癌癥中分別排名第3位和第2位[1]。CRC的發(fā)生、發(fā)展除受遺傳因素影響外，慢性腸炎也是其重要的風險因素[2]。

近年來，大量研究表明腸道菌群失調(diào)在慢性腸炎及炎癥相關(guān)CRC的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要角色。厭氧消化鏈球菌(Peptostreptococcusanaerobius，P.anaerobius)、嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila，A.muciniphila)、脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis,B.fragilis)、共生梭菌(Clostridiumsymbiosum,C.symbiosum)等可能作為致病菌促進腸炎及炎癥相關(guān)CRC的發(fā)展[3-6]。益生菌乳酸桿菌屬(Lactobacillusspp.)則在維持腸道健康和調(diào)節(jié)免疫功能方面具有重要作用[7]。

云芝糖肽(polysaccharopeptide，PSP)是分離自液體深層發(fā)酵的云芝(Trametesversicolor, 彩絨革蓋菌)Cov-1菌株菌絲體的結(jié)合蛋白多糖，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等多種生物活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PSP還可調(diào)節(jié)人的腸道菌群組成[8-9]，但對慢性腸炎及炎癥相關(guān)CRC的預防作用及對相關(guān)致病菌的影響尚不明確。本研究以氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導小鼠炎癥相關(guān)CRC模型，探討PSP對部分相關(guān)腸道致病菌的影響，以期為今后進一步研究PSP對CRC的預防和治療作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠30只，雄性，4周齡，SPF級，購于上海斯萊克實驗動物有限公司〔許可證號：SCXK(滬)2017-0005〕。所有動物在潔凈動物房內(nèi)飼養(yǎng)，并按上海市實驗動物管理辦法[10]操作。所有注射和灌胃藥物、飲用水、飼料和墊料均經(jīng)滅菌處理。

1.2 試劑及材料

AOM購自Sigma公司， DSS(相對分子質(zhì)量 36 000～50 000)購自MP Biomedicals公司，QuantiNovaTMSYBR?Green PCR Kit (貨號：208054)購于QIAGEN公司，E.Z.N.A.?Stool DNA Kit (貨號：D4015)購于OMEGA Bio-tek公司，PSP由上海芝草生物技術(shù)有限公司提供，發(fā)酵設備BIOTECH-5BG購于上海保興生物設備工程有限公司，實驗用細菌引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 試驗分組將30只小鼠經(jīng)過2周的混合共籠飼養(yǎng)后，隨機分為對照組、模型組、PSP預防組，每組各10只。

1.3.2 動物模型建立及給藥模型組及PSP組于分組后首日腹腔注射AOM(10 mg/kg),7 d后進行3輪DSS處理，每輪處理包括1周2.5% DSS飲水和2周正常飲水，以建立動物模型。自注射AOM當日起，PSP組每日灌胃PSP(650 mg/kg)至實驗結(jié)束。對照組注射相應生理鹽水并維持自由飲食。

1.3.3 疾病活動指數(shù)分析DSS處理期間(d7～d70)，每日對小鼠稱重，并記錄糞便形態(tài)和便血情況，按照文獻[11]中的規(guī)則，進行疾病活動指數(shù)(disease activity index, DAI)評分。

1.3.4 細菌相對豐度測定分別于開始(d0)、中期(d49)、后期(d70 )和處死前(d84 )收集小鼠新鮮糞便，用試劑盒提取總DNA。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，real-time qPCR)，對各菌的特異性引物進行擴增，以細菌16S通用引物作內(nèi)參，計算各菌相對豐度。具體步驟和條件按試劑使用說明進行。獲得的Ct值以2-ΔCt·104表示各菌種(屬)的相對豐度，其中ΔCt=Ct特異引物-Ct16S通用引物。各引物序列如表1所示。

表1 Real-time qPCR細菌引物序列

Tab.1 Primer sequences for bacterial real-time qPCR

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 PSP緩解小鼠腸炎癥狀及降低DAI評分

DSS處理期間模型組和PSP組小鼠均出現(xiàn)稀便、便血及體重減輕等癥狀，對照組小鼠體重平穩(wěn)增加且糞便正常。DAI評分模型組、PSP組均顯著高于對照組(P<0.001)。第1輪及第2輪DSS處理d7時，PSP組的DAI評分均顯著低于模型組(P<0.05和P<0.01，圖1A)。第3輪DSS處理后PSP組部分小鼠便血、腹瀉癥狀明顯加重，組內(nèi)差異較大，兩組間DAI評分無顯著性差異，模型組部分小鼠出現(xiàn)脫肛(圖1B)現(xiàn)象，PSP組無脫肛出現(xiàn)。

A: Diseases Active Index of each round DSS,*:P<0.05,**:P<0.01, ns: not significant, ▲: Compare to group control,P<0.001. B: Representative graph of anal prolapse in model group.

圖1 PSP對DSS誘導的小鼠DAI的影響

Fig.1 PSP alleviated the increases of DSS-induced mouse DAI scores

2.2 PSP下調(diào)4種CRC相關(guān)潛在致病菌的相對豐度

2.2.1P.anaerobius的相對豐度對照組P.anaerobius的相對豐度趨于穩(wěn)定，在不同時間點上無顯著變化。模型組的豐度有隨時間增加的趨勢，且在后期(d70)顯著高于對照組(P<0.05)。PSP組該菌相對豐度開始時略高于對照組，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 在中期(d49)顯著低于起始水平(P<0.05)，且在中、后期和結(jié)束時均低于模型組(圖2A)。

2.2.2A.muciniphila的相對豐度對照組和模型組的A.muciniphila相對豐度未見顯著變化。PSP組在中期(d49)顯著降低(P<0.01)，且結(jié)束前(d84)低于模型組，但沒有統(tǒng)計學意義(圖2B)。

2.2.3B.fragilis的相對豐度對照組B.fragilis相對豐度無顯著變化。模型組相對豐度隨時間增加，并在中、后期和結(jié)束時均高于對照組，但不顯著(P>0.05)。PSP組在中、后期的豐度均顯著低于初始水平(P<0.05和P<0.05)，并顯著低于模型組(P<0.01和P<0.05)(圖2C)。

A: Relative abundance ofP.anaerobius. B: Relative abundance ofA.muciniphila. C: Relative abundance ofB.fragilis. D: Relative abundance ofC.symbiosum. Compare to Day0,*:P<0.05,**:P<0.01.

圖2 PSP對腸癌相關(guān)潛在致病菌豐度的影響

Fig.2 Effects of PSP on relative abundance of potential pathogenic entero-bacteria associated with CRC

2.2.4C.symbiosum的相對豐度各組內(nèi)C.symbiosum的相對豐度個體差異較大，對照組的豐度隨時間延長無顯著變化。模型組相對豐度在中期(d49)有增加趨勢，但無統(tǒng)計學意義。PSP組的相對豐度在中期時降低，在中、后期均低于模型組，在d70時兩者有顯著差異(P<0.05) (圖2D)。

2.3 益生菌Lactobacillus spp.的相對豐度不受PSP的影響

與初始水平相比，對照組益生菌Lactobacillusspp.的相對豐度在中期(d49)及以后均有增加，但不顯著。模型組該菌的相對豐度在中期(d49)時降低，后期時回升并在結(jié)束時超過起始豐度。PSP組該菌豐度變化與模型組相似，在各時間點模型組與PSP組間該菌相對豐度無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

3 討論

炎癥是誘發(fā)CRC的重要因素，而腸道菌群的失衡與炎癥及CRC的發(fā)生也有著緊密聯(lián)系?？寡鬃饔煤途S持腸道菌群的平衡可降低CRC發(fā)生的風險[16]。

PSP在臨床上通常作為免疫調(diào)節(jié)劑用于癌癥患者術(shù)后的輔助治療， 同時研究發(fā)現(xiàn)PSP還具有抗炎作用，可減少脂多糖誘導的小鼠巨噬細胞中炎性因子一氧化氮、前列腺素E2和白細胞介素1β的生成，并下調(diào)環(huán)氧合酶2和一氧化氮合酶的表達[17]。小鼠灌胃給予PSP還可顯著降低二甲苯導致的耳腫脹[18]。近年來一項體外模型研究及哈佛醫(yī)學院的臨床研究發(fā)現(xiàn)，PSP還可改變?nèi)说哪c道菌群組成[8-9]，但PSP對炎癥相關(guān)CRC的預防作用目前尚未見報道。本研究用AOM/DSS誘導小鼠炎癥相關(guān)CRC模型后，對模型小鼠給予PSP以探討PSP對DSS所致炎癥的緩解作用及CRC相關(guān)腸道菌豐度的影響。

圖3 PSP對益生菌Lactobacillusspp.相對豐度的影響

Fig.3 Effects of PSP on relative abundance of probioticLactobacillusspp.

AOM是一種化學誘變劑，可導致DNA烷基化而誘導癌變。DSS是一種人工合成的硫酸鹽多糖，其對結(jié)腸上皮細胞有毒性作用，小鼠飼喂DSS往往出現(xiàn)以血便、腸道黏膜潰瘍和粒細胞浸潤為特征的結(jié)腸炎癥。使用AOM/DSS，在較短的時間內(nèi)可誘發(fā)小鼠炎癥相關(guān)CRC的發(fā)生[19]。本研究中，經(jīng)DSS處理，小鼠出現(xiàn)體重減輕、便血、稀便等癥狀， DAI評分顯著升高，說明小鼠模型成功建立。試驗中PSP組小鼠前兩輪給予PSP，結(jié)果小鼠的癥狀減輕并顯著降低DAI評分，提示PSP可能通過抗炎機制緩解了DSS導致的結(jié)腸炎癥，對炎癥相關(guān)CRC的發(fā)生、發(fā)展有潛在的預防作用。但第3輪DSS處理后，PSP組因個體差異增加，部分小鼠便血、腹瀉癥狀明顯加重，且DAI評分升高，與模型組相比，組間評分無統(tǒng)計學差異，但模型組小鼠出現(xiàn)的脫肛現(xiàn)象未在PSP組發(fā)現(xiàn)。如果在該階段進行結(jié)直腸病理分析，進一步觀察炎癥損傷情況，可能會發(fā)現(xiàn)更能清晰反映兩組炎癥程度的差異。

DSS誘發(fā)的炎癥可導致小鼠腸道微生物多樣性降低、菌群結(jié)構(gòu)顯著改變，且菌群紊亂與其導致的免疫系統(tǒng)改變相關(guān)[20-21]，而腸道免疫功能的改變反過來對腸道菌群組成也有顯著影響[22]。當腸道菌群失衡時，某些腸道細菌豐度增加，通過分泌毒素及其代謝產(chǎn)物或刺激腸道免疫系統(tǒng)可誘發(fā)或促進CRC的發(fā)生、發(fā)展[23]。比如CRC患者的糞便和結(jié)腸黏膜組織中P.anaerobius的豐度顯著高于健康個體，用P.anaerobius給C57BL/6小鼠灌胃可顯著增加結(jié)腸增生[3]。本研究中AOM/DSS處理后P.anaerobius相對豐度隨時間增加，而PSP則可抑制這種趨勢。還有研究發(fā)現(xiàn)FabplCre; Apc15lox/+小鼠腸道腫瘤發(fā)生率與A.muciniphila的豐度有關(guān)，灌胃該菌株顯著增加腫瘤發(fā)生[4]。本研究中造模及時段并未影響對照組和模型組中A.muciniphila的相對豐度，但PSP組中該菌豐度在各時間點均有低于模型組的趨勢，提示PSP也可減少該菌的豐度。產(chǎn)腸毒素型B.fragilis(ETBF)在腸道中的豐度與結(jié)腸炎和腫瘤發(fā)生呈正相關(guān)，用ETBF給ApcMin/+小鼠灌胃可誘導結(jié)腸炎和腫瘤發(fā)生[5]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組中B.fragilis豐度高于對照組，而PSP可顯著降低該菌豐度，提示PSP對該菌相關(guān)的CRC發(fā)生具有潛在預防作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)C.symbiosum相對豐度隨腫瘤進展增加，且通過C.symbiosum相對豐度對早期CRC的預測性比具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)更好[6]。本研究中對照組和模型組的C.symbiosum豐度都較高，且隨時間增加未見明顯變化，但給予PSP可降低該菌的相對豐度。其中的機制可能是PSP具有益生元活性，另外PSP是否可能通過調(diào)控免疫功能間接影響腸道菌群組成也值得進一步研究。本文采用AOM/DSS誘導小鼠腸炎相關(guān)CRC模型，探究了PSP對腸癌相關(guān)潛在致病菌及益生菌相對豐度的影響，結(jié)果初步表明PSP可減輕小鼠腸炎癥狀，并可降低腸道潛在致病菌P.anaerobius、A.muciniphila、B.fragilis和C.symbiosum的相對豐度。綜上所述，AOM/DSS造模過程中PSP可一定程度降低腸癌相關(guān)致病菌P.anaerobius、A.muciniphila、B.fragilis和C.symbiosum的相對豐度，提示PSP可能通過降低CRC相關(guān)致病菌豐度對腸炎相關(guān)CRC產(chǎn)生潛在的預防作用。PSP對炎癥相關(guān)CRC的預防作用及其減輕腸炎的分子機制等還需進一步研究。

Lactobacillusspp.是腸道中豐度最高的益生菌屬，CRC的發(fā)生通常伴隨著其豐度的降低[24]，而增加其豐度則有潛在的預防和治療效果。體外研究發(fā)現(xiàn)PSP能夠顯著提高健康人糞便發(fā)酵液中雙歧桿菌屬和Lactobacillusspp.的豐度[8]。而本研究中造模同時給予PSP并未對Lactobacillusspp.的相對豐度產(chǎn)生明顯影響，這可能與體外與體內(nèi)的環(huán)境差異以及模型小鼠和健康人腸道菌群組成差異有關(guān)。