基于15N 同位素示蹤技術(shù)的烤煙品種上部葉氮積累和氨揮發(fā)量差異分析

徐清泉，劉化冰，尚曉潁，程昌合，張曉兵，夏 琛*，張勇剛，金慧清，徐世曉，楊鐵釗，鄒光進

1. 浙江中煙工業(yè)有限責任公司，杭州市上城區(qū)中山南路77 號 310024

2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95 號 450002

3. 貴州省煙草公司黔東南分公司，貴州省凱里市清江路33 號 556000

氮素在烤煙生長發(fā)育過程中起著重要作用，對煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響［1-3］?？緹煹牡刂饕獊碓从谕寥乐械牡ㄍ寥赖┖头柿现械牡ǚ柿系?，在一定生態(tài)和品種條件下，施肥是調(diào)控煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的重要手段［4-5］。時向東等［6］研究表明，隨著烤煙生育期的推進，煙葉中氮積累量在旺長期增幅最大，煙株對土壤氮的吸收積累量顯著高于肥料氮，同時肥料氮占總氮含量的比例不斷降低；楊志曉等［7］研究提出，烤煙在生育前期以吸收肥料氮為主，在成熟期后以吸收土壤氮為主，煙株整個生育期吸收的氮素主要來源于土壤氮，且吸收的土壤氮及占總氮含量的比例隨生育期的推進和葉片著生部位的升高而增加。氨氣揮發(fā)是植物氮素再轉(zhuǎn)移的主要形式之一，煙葉在衰老過程中氮素營養(yǎng)物質(zhì)降解導(dǎo)致了葉片NH4+積累并通過質(zhì)外體以氨氣的形式揮發(fā)到大氣中［8-9］。Mattsson 等［10］發(fā)現(xiàn)兩種不同基因型煙草的氨氣揮發(fā)量相差1 倍以上，原因是品種間質(zhì)外體NH4+濃度和pH 存在差異；武云杰等［11］研究提出，不同烤煙品種煙葉氨氣揮發(fā)量隨葉齡增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，氮素利用效率低的品種氮素轉(zhuǎn)移量和氨氣揮發(fā)量大。近年來隨著卷煙大品牌的發(fā)展，優(yōu)質(zhì)煙葉資源供求矛盾日益凸顯，等級結(jié)構(gòu)不合理，煙葉使用效率低的問題一直存在［12］。上部葉占整株煙葉的三分之一，占總產(chǎn)量的35%左右。目前我國上部煙葉存在的主要問題是碳氮代謝不夠協(xié)調(diào)，煙葉成熟不充分，導(dǎo)致葉片結(jié)構(gòu)緊實，內(nèi)在化學(xué)成分協(xié)調(diào)性不佳，刺激性大，勁頭足［13-14］。貴州黔東南地區(qū)屬中亞熱帶季風濕潤氣候，植煙地多位于海拔800 m 左右的山地，晝夜溫差大，降雨量分布不均勻，烤煙生長期間存在前期供氮不足，后期供氮過剩的問題，嚴重影響優(yōu)質(zhì)烤煙的生產(chǎn)，尤其是上部葉的成熟度［15］。為此，利用15N 同位素肥料作為全部供氮肥料，進行了黔東南煙區(qū)烤煙上部葉氮含量、氮素積累量、土壤氮和同位素肥料氮積累比例，以及上部葉的氨揮發(fā)量試驗，并分析了黔東南煙區(qū)上部葉的氮素狀況和氨揮發(fā)量在品種間的差異，旨在為合理調(diào)控煙草施肥水平，提高上部葉的可用性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2017 年在黔東南苗族侗族自治州“利群”舞陽基地單元進行，供試烤煙品種為云煙87和K326。土壤類型為黃壤，土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分狀況：全氮1.11 g/kg，堿解氮50.9 mg/kg，有效磷8.7 mg/kg，緩效鉀179.2 mg/kg，速效鉀53.6 mg/kg，有機質(zhì)16.01 g/kg，pH 6.43。

1.2 試驗設(shè)計

以當?shù)赝扑]的最佳氮用量97.5 kg/hm2為準，試驗區(qū)施用同位素標記的氮肥為15（基肥，占70%）和K15NO3（追肥，占30%），兩種肥料15N 豐度分別為10.21%和10.28%，由上?；ぱ芯吭?提 供。磷 肥 為Ca（H2PO4）2，鉀 肥 為K2SO4和KNO3，磷 肥、鉀 肥 用 量 分 別 為633.10 kg/hm2、471.11 kg/hm2，于煙苗移栽前穴施。作基肥的氮肥于移栽前穴施，移栽后30 d 追施30%的氮肥。煙苗于4 月10 日移栽，行株距120 cm×55 cm，四周設(shè)置保護行，在施有同位素氮肥的壟上植煙40 株，采用隨機區(qū)組，兩品種均設(shè)置3 個試驗處理小區(qū)，每小區(qū)為1 次重復(fù)，共計6 個小區(qū)。按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進行田間管理，每小區(qū)按照5點取樣法取土壤樣品。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 煙樣的采集

于移栽后7、9、11、13 和15 周分別取3 株煙，上部葉為15～18 葉位（從下到上）。采集煙樣后一部分樣品于105 ℃殺青30 min，并在70 ℃烘干至恒質(zhì)量。粉碎，過0.25 mm 網(wǎng)篩，用于全氮含量和15N 豐度的測定，并計算烤煙的氮素吸收積累量。每份樣品均平行檢測3 次。

1.3.2 氮含量的測定

采用凱氏定氮法測定煙株全氮含量［16］；采用質(zhì)譜法測定同位素15N 標記的原子百分超［17］。

1.3.3 氨氣揮發(fā)量的測定

圖1 氨氣收集裝置Fig.1 Ammonia gas collection device

烤煙葉片氨氣揮發(fā)量的測定裝置如圖1所示［18］。采用密閉室間歇通氣法收集氨氣［19］，先用聚乙烯塑料薄膜袋（透光率90%）套住待測定的葉片，薄膜袋口部密封；再通過微型充氣泵將空氣通入含有0.5 mol/L H2SO4的三角瓶中，除去空氣中的NH3；讓氣體通過葉片后，再通過0.005 mol/L 的H2SO4溶液的串聯(lián)裝置收集。打開電源，在氣密性良好的情況下收集24 h，匯集收集液。采用質(zhì)譜法測定氨氣收集液中15N 標記的原子百分超［17］。

1.4 計算方法

參照時向東等［6］的方法計算煙株吸收的氮素來源于肥料和土壤的量，參照武云杰等［11］的方法計算煙葉氨揮發(fā)來源于肥料和土壤的量。計算公式為：

煙株吸收的肥料氮占總吸收氮量的百分比（Ndff%）=［（烤煙中15N 原子百分超-0.365%）/（肥料的15N 原子百分超-0.365%）］×100% （1）

式中：0.365%是自然界中15N 含量；Ndff 表示來自肥料的氮素，簡稱肥料氮。Ndff=Ndff%×煙株各部位累計的總氮量 （2）Ndfs=作物吸氮量-Ndff （3）式中：Ndfs 表示來自土壤本身的氮素，簡稱土壤氮。

烤煙煙葉的氨揮發(fā)量：

NH3-N［μg·m-2·h-1］=［M/（A×D）］×10-2（4）

式中：M 為每次測得的氨量（NH3-N，μg）；A為裝置的橫截面積（m2）；D 為每次連續(xù)吸氨時間（h）。

肥料氮氨揮發(fā)量=（氨氣收集液中15N 原子百分超/煙葉中15N 原子百分超）×100%×氨總揮發(fā)量

（5）

土壤氮氨揮發(fā)量=氨總揮發(fā)量-肥料氮氨揮發(fā)量（6）

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 初步處理數(shù)據(jù)并繪制圖表，用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期烤煙上部葉氮含量和氮素積累量的變化

由圖2 可以看出，兩個品種烤煙上部葉的氮含量隨著生育期的推進，總體呈現(xiàn)下降趨勢，在移栽后77 d 下降比較明顯，云煙87 和K326 上部葉下降比例分別達到45.28%和43.86%。在整個生育期中云煙87 上部葉的氮含量總體小于K326 的上部葉的氮含量，差異達到極顯著水平。在生育后期77、91 和105 d 時間段內(nèi)，兩個品種上部葉的氮含量基本穩(wěn)定，下降幅度不明顯。說明在同等條件下，不同品種的上部葉氮含量間存在極顯著差異，但品種間氮含量變化規(guī)律差異不明顯。

圖2 不同生育期兩品種烤煙上部葉氮含量變化Fig.2 Changes of nitrogen content in upper leaves of two flue-cured tobacco varieties at different growth stages

圖3 不同生育期兩品種烤煙上部葉氮積累量變化Fig.3 Changes of nitrogen accumulation in upper leaves of two flue-cured tobacco varieties at different growth stages

由圖3 可以看出，兩個品種烤煙上部葉的氮積累規(guī)律相似，隨生育期的推進呈先升高后降低的趨勢，在移栽后63 d 兩品種的氮積累量達到峰值，云煙87 和K326 的上部葉氮積累量分別為1.36 g/株和1.49 g/株，兩品種在移栽后63 d 的氮素含量較高，但較移栽后49 d 沒有明顯變化。說明在移栽后63 d 對上部葉來說是氮素吸收分配的關(guān)鍵節(jié)點，移栽后63 d 煙株處于旺長期，此時上部葉氮積累量也達到峰值；移栽后91 d 烤煙兩品種的上部葉氮積累量與移栽后77 d 相比差異較小，可能是由于實施煙株打頂抹杈等大田農(nóng)藝管理措施，人為改變了氮積累的庫源，而對上部葉氮素積累產(chǎn)生一定影響，導(dǎo)致煙株對氮素重新進行分配。不同品種間上部葉的氮積累規(guī)律相似，但在積累量上的差異達極顯著水平，說明K326 上部葉的氮積累能力大于云煙87。

2.2 不同生育期烤煙上部葉中來源于土壤和肥料的氮素積累量的變化

圖4 不同生育期兩品種烤煙上部葉來源于土壤和肥料的氮積累量變化Fig.4 Changes of nitrogen accumulation in upper leaves of two flue-cured tobacco varieties from soil and fertilizer at different growth stages

從烤煙兩品種上部葉對兩種氮源吸收的情況（圖4）來看，氮積累來源于土壤和肥料氮中的量變化規(guī)律與總氮積累規(guī)律一致，即隨生育期的推進均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，同時在移栽后63 d是兩品種上部葉氮積累的關(guān)鍵節(jié)點，且氮積累量達到峰值。移栽后63 d 之前，兩烤煙品種上部葉的氮源主要來自肥料氮，在移栽后63 d 之后土壤氮作為主要氮源供給兩品種上部葉的生長發(fā)育。說明試驗點土壤在烤煙上部葉生長發(fā)育后期有較強的供氮能力，且煙株上部葉的氮積累量主要來自土壤氮。

2.3 不同生育期烤煙上部葉氨揮發(fā)量的變化

從圖5可以看出，兩個品種烤煙上部葉氨揮發(fā)基本呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但兩個品種氨揮發(fā)量峰值出現(xiàn)的時間段存在差異，K326品種的峰值出現(xiàn)在移栽后91 d，達到10.96 μg·m-2·h-1，云煙87氨揮發(fā)峰值出現(xiàn)在移栽后77 d，達到19.98 μg·m-2·h-1。在移栽后91 d 之前，兩個品種上部葉氨揮發(fā)量間差異極顯著，在移栽后105 d 時，兩個品種的氨揮發(fā)量趨于平穩(wěn)，差異不明顯。說明在相同的生態(tài)環(huán)境條件下，不同品種上部葉在生育期中的氨揮發(fā)量存在差異。

圖5 不同生育期兩品種烤煙上部葉的氨揮發(fā)量變化Fig.5 Changes of ammonia volatilization in upper leaves of two flue-cured tobacco varieties at different growth stages

2.4 不同生育期烤煙上部葉氨揮發(fā)中氮源的變化

從圖6 可以看出，兩個品種上部葉氨揮發(fā)中氮源的變化趨勢一致，移栽后77 d 為1 個時間節(jié)點，移栽后77 d 之前氨揮發(fā)中的氮主要來源于土壤氮，移栽后77 d 之后則主要來源于肥料氮。不同品種氨揮發(fā)氮源間差異極顯著，且氮源的比例在不同品種間存在顯著差異。說明上部葉氨揮發(fā)中的氮源主要來源于肥料氮，煙株生長發(fā)育后期氨揮發(fā)量大于生長發(fā)育前期。

圖6 不同生育期烤煙兩品種上部葉來源于土壤氮和肥料氮中氨揮發(fā)量的變化Fig.6 Changes of ammonia volatilization in upper leaves of the two flue-cured tobacco varieties from soil and fertilizer nitrogen at different growth stages

3 討論

有研究表明［20-23］，烤煙前期的生長發(fā)育以吸收肥料氮為主，之后土壤氮的比例逐步提高，而且隨著煙株生育期的推進和葉片著生部位的升高，土壤氮的比例顯著增加。本試驗中，移栽后63 d之前，兩烤煙品種上部葉的氮主要來源于肥料氮，在移栽后63 d 之后土壤氮作為主要氮源供烤煙上部葉的生長發(fā)育，與前人的研究結(jié)果一致。說明黔東南煙區(qū)土壤中殘留的全氮和速效氮對烤煙上部葉氮素營養(yǎng)有重要影響，對土壤中殘留氮素的有效控制是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)烤煙上部葉的重要條件。本試驗結(jié)果顯示，不同品種上部葉氮含量和氮素積累量的變化趨勢基本一致，氮素含量隨著生育期的推進，總體呈下降趨勢；氮素積累量呈先升高后降低的趨勢，在移栽后63 d，上部葉氮積累量達到峰值，與鄧云龍等［24］的研究結(jié)果基本一致。但不同品種上部葉的氮素含量和積累量間差異達極顯著水平，說明不同品種對氮素營養(yǎng)的響應(yīng)存在基因型上的差異，在黔東南目前的條件下云煙87 品種上部葉在氮素積累、利用及對氮素營養(yǎng)響應(yīng)上低于K326。

陳剛等［25］研究表明，葉片進入生長發(fā)育后期，蛋白水解酶活性顯著增強，產(chǎn)生大量的NH3。正常情況下，多余的NH3由于谷氨酰胺合成酶的作用會被重新利用，生育后期因為谷氨酰胺合成酶活性減弱，多余NH3難以被再次轉(zhuǎn)化利用，經(jīng)質(zhì)外體由葉片揮發(fā)到大氣中。劉化冰等［26］研究認為，不同烤煙品種在田間的耐肥性差異，也與生育后期經(jīng)過葉片揮發(fā)的氨氣量有關(guān)，田間表現(xiàn)耐肥性高、容易成熟落黃的品種，在生育后期的氨氣揮發(fā)總量大于不耐肥的烤煙品種。本試驗結(jié)果表明，黔東南兩個主栽品種上部葉氨揮發(fā)量的變化規(guī)律一致，均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，但兩個品種氨揮發(fā)量峰值出現(xiàn)的時間段和氨揮發(fā)總量存在差異。與K326 品種相比，云煙87 品種氨揮發(fā)量峰值出現(xiàn)的時間段提前，且氨揮發(fā)總量較大，表明云煙87 品種上部葉對氮素響應(yīng)和再利用劣于K326 品種，但K326 品種成熟時間短且更易落黃，與這兩個品種在黔東南產(chǎn)區(qū)實際的大田生產(chǎn)表現(xiàn)一致。通過對兩個品種上部葉氨揮發(fā)中氮來源的研究發(fā)現(xiàn)，在生長發(fā)育前期兩個品種氨揮發(fā)的氮源主要為土壤氮，而后期則為肥料氮，也印證了侯雪坤等［27］的研究結(jié)果，即烤煙前期生長發(fā)育吸收的氮素以肥料氮為主，后期土壤氮的比例逐步提高。表明上部葉的生長發(fā)育過程，特別是上部葉在生育后期對肥料氮的利用很少，土壤氮是上部葉氮素營養(yǎng)的主要來源，對上部葉的品質(zhì)形成有重要影響。因此，針對黔東南的地形地貌和氣候條件，在煙稻輪作（田煙）模式下對優(yōu)質(zhì)烤煙上部葉的生產(chǎn)應(yīng)選擇氮素響應(yīng)不敏感、耐肥性高的品種，并且要選擇土壤中全氮和速效氮含量中等的田塊。

4 結(jié)論

黔東南煙區(qū)云煙87 和K326 兩個品種烤煙氮素積累量和氨揮發(fā)量隨生育期的推進均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中云煙87 氮含量低于K326，而云煙87 氨揮發(fā)量在各生育階段均高于K326。兩個品種烤煙上部葉氮積累來源于土壤氮的比例隨生育期推進逐漸上升，而氨揮發(fā)的氮源主要來自肥料氮。兩個品種烤煙上部葉氮素積累和氨揮發(fā)量存在極顯著差異，云煙87 對氮素的吸收量和利用率低于K326。因此，黔東南煙區(qū)土壤氮對上部葉的氮素營養(yǎng)起主導(dǎo)作用，不同烤煙品種上部葉對土壤氮和肥料氮的利用率存在差異。