不同濃度鉬酸鈉對(duì)白肋煙苗期碳氮代謝和硝酸鹽含量的影響

馮雨晴，李亞飛，2，史宏志*，周 駿，白若石，馬雁軍，林淑貞

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙草農(nóng)業(yè)減害研究中心，鄭州市金水區(qū)文化路95 號(hào) 450002

2. 河南經(jīng)貿(mào)職業(yè)學(xué)院，鄭州市鄭東新區(qū)龍子湖北路58 號(hào) 450018

3. 上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司北京卷煙廠，北京市通州區(qū)萬盛南街99 號(hào) 100024

白肋煙煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)和安全性對(duì)卷煙品質(zhì)有較大影響。Lewis 等［1］研究表明，白肋煙Yb 基因突變導(dǎo)致其煙葉色素含量低，光合作用弱，含碳化合物含量低，易出現(xiàn)煙葉硝酸鹽大量積累和氮素利用率低等問題［2-3］。煙草葉片中的硝酸鹽是煙葉和煙氣中煙草特有亞硝胺（TSNAs）的重要前體物，且煙葉硝酸鹽含量與TSNAs 積累呈顯著直線相關(guān)關(guān)系［4-6］。因此，減少煙葉中硝酸鹽積累量對(duì)降低煙葉TSNAs 形成和提高卷煙安全性具有重要意義。有研究表明，煙葉硝酸鹽含量與碳氮代謝密切相關(guān)［7-8］，氮還原同化能力弱和物質(zhì)能量供應(yīng)不足是引起白肋煙煙葉硝酸鹽積累的主要原因［9］?？梢姡岣邿熑~光合碳固定和氮同化能力是降低煙葉硝酸鹽含量的重要途徑。

鉬素（Mo）是煙草生長必需的微量元素，且鉬是醛氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、黃嘌呤脫氫酶等的組成成分，能促進(jìn)植物色素合成，對(duì)煙草氮素營養(yǎng)吸收及提高煙葉葉綠素含量和穩(wěn)定性、增強(qiáng)光合能力、促進(jìn)碳水化合物合成轉(zhuǎn)移和提高作物產(chǎn)量等有重要作用［10-12］。硝酸還原酶（NR）是一種水溶性鉬黃蛋白，參與硝態(tài)氮還原為氨的過程，且有利于蛋白質(zhì)合成，而鉬素作為NR 的必須組分，直接影響NR 活性。因此，鉬在氮代謝過程中起著核心作用［13-14］。植物缺鉬癥狀與缺氮癥狀較為相似，推測(cè)是由于缺鉬導(dǎo)致NR 活性喪失，造成氮素還原作用異常，氮素同化作用受影響，進(jìn)而呈現(xiàn)出類似缺氮的癥狀［15-16］。施鉬可提高烤煙生長發(fā)育中前期葉綠素含量，增加光合速率，從而促進(jìn)光合產(chǎn)物的形成，提高煙葉產(chǎn)量［17-19］。同時(shí)，施鉬對(duì)植物葉片NR 有激活作用，能促進(jìn)植物氮代謝，降低植物體內(nèi)硝酸鹽含量，提高氮肥利用效率［20-21］。煙草中鉬是通過土壤以鉬酸根離子的形式被根系吸收利用，而通過葉面噴施煙草葉片也可以吸收鉬，且比根系吸收更快［17］。李亞飛等［22］研究表明，施用鉬酸銨能提高烤煙煙葉NR 活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成；秦亞光等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著施鉬量的增加，烤煙硝酸鹽含量降低；廖曉勇等［24］研究提出，施鉬對(duì)煙草農(nóng)藝性狀的各項(xiàng)指標(biāo)均有促進(jìn)作用；崔國明等［12］試驗(yàn)認(rèn)為，烤煙施Mo 能促進(jìn)煙株生長，協(xié)調(diào)煙株生理代謝，增加煙葉產(chǎn)量和產(chǎn)值，改善煙葉品質(zhì)。同時(shí)，國外的一些研究也表明，Mo 在植物氮素代謝過程中扮演著重要的角色，參與植物體的生物固氮、硝酸鹽還原以及含氮化合物運(yùn)輸?shù)龋?5-27］。在豆科植物和非豆科植物中，施鉬可提高大豆、水稻和大麥的硝酸還原酶活性，促進(jìn)氮代謝，降低植株硝酸鹽含量，進(jìn)而提高氮肥利用率［28-30］。Elrys 等［31］研究表明，施用鉬濃度100 mg/L 時(shí)馬鈴薯塊莖中硝酸鹽含量顯著降低?？梢姡壳坝嘘P(guān)鉬對(duì)烤煙和植物生長和品質(zhì)影響的研究已有報(bào)道，但鉬對(duì)白肋煙苗期生物量積累和碳氮代謝影響的研究卻鮮有涉及。為此，設(shè)置了不同鉬酸鈉濃度噴施試驗(yàn)，旨在明確鉬酸鈉對(duì)白肋煙色素含量、光合作用、氮素還原同化作用、硝酸鹽含量和碳氮化合物協(xié)調(diào)性的影響，并篩選出白肋煙苗期鉬酸鈉的適宜施用濃度，為白肋煙減害和煙葉品質(zhì)的提高提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙苗培育

試驗(yàn)于2017 年4 月在國家煙草生理生化研究基地人工氣候室內(nèi)進(jìn)行。氣候室條件設(shè)置：溫度22～28 ℃，每12 h晝夜光暗交替（白天時(shí)間段設(shè)置為7：00—19：00），光照強(qiáng)度800 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度85%。供試白肋煙品種為TN90，在人工氣候室內(nèi)采用漂浮育苗，煙草種子用2%次氯酸鈉溶液消毒2次，每次5 min，隨后將其播種在填滿基質(zhì)的200 孔育苗盤中。浮盤規(guī)格：長78 cm，寬38 cm，高5.5 cm，每盤200孔。育苗框規(guī)格：長82 cm，寬45 cm，高20 cm，每框1 個(gè)浮盤，育苗時(shí)在框中加入10 L 清水，待煙苗長至大十字期時(shí)開始加入Hoagland 營養(yǎng)液［8］。待煙苗長至4～5 片真葉（苗齡40 d 左右）時(shí)，選取長勢(shì)均勻一致的壯苗，用去離子水將根系沖洗干凈后，移栽至小花盆中（規(guī)格7.1 cm×6.7 cm×7.8 cm），每盆1 株，煙苗長至七葉一心時(shí)進(jìn)行噴施處理。每處理選取10 株長勢(shì)均勻一致的煙苗，共計(jì)50株。用清水和不同濃度鉬酸鈉溶液于每天17：00時(shí)對(duì)煙苗葉片正反面進(jìn)行噴施，至葉片上液滴均勻且欲下滴時(shí)為止，連續(xù)噴施3 d，最后1 次噴施后間隔7 d 取樣測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置5個(gè)處理，即處理1 為清水對(duì)照（CK）；處理2 為0.1%鉬酸鈉；處理3 為0.5%鉬酸鈉；處理4 為1.0%鉬酸鈉；處理5 為2.0%鉬酸鈉。每處理設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 樣品處理

在最后一次噴施后7 d 取樣并進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。將各處理煙苗平均分成兩份，分別用于新鮮樣品檢測(cè)和殺青樣品保存。樣品分組后，將各處理煙苗的根、莖、葉分離，用去離子水清洗干凈，并用吸水紙吸干后進(jìn)行測(cè)定和樣本保存。

新鮮樣本用于煙葉色素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、硝酸還原酶活性（NRA）和可溶性蛋白質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）測(cè)定。殺青樣品的制作方法：將各處理樣品葉片清潔干凈后，放入烘箱中于105 ℃殺青20 min，60 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量，磨碎，過0.3 mm（60目）篩，用于煙葉干物質(zhì)積累量、含量和常規(guī)化學(xué)成分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的測(cè)定。

1.3.2 煙草光合速率的測(cè)定

選取各處理長勢(shì)均勻一致的煙苗，采用便攜式光合測(cè)定儀（LI-6400，美國Licor 公司）測(cè)定光合速率。該儀器為開放式氣路，紅藍(lán)光源，光照強(qiáng)度為800 μmol·m-2·s-1，測(cè)定時(shí)間為8：30—10：00，測(cè)定對(duì)象為煙苗最大功能葉（從下向上數(shù)，第3 葉位）［32］。每處理重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.3 煙葉NRA、色素和可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

選取各處理長勢(shì)均勻一致的煙苗，選擇最大功能葉的6～8 支脈（位于葉尖與葉基中部）之間葉肉，用剪刀剪成2 mm × 5 mm 條狀，混勻后用于煙葉NRA、可溶性蛋白含量、色素含量的測(cè)定，每處理數(shù)據(jù)為3 次重復(fù)的平均值。采用95%乙醇提取法測(cè)定色素含量，采用活體法測(cè)定NR 活性，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量［14］。

1.3.4 總氮、總糖和還原糖含量的測(cè)定

采用濃H2SO4水楊酸法測(cè)定煙葉含量［33］。煙葉總氮、總糖和還原糖含量按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［34-35］用連續(xù)流動(dòng)分析儀（AA3，德國BRAN+LUEBBE 公司）檢測(cè)。

煙葉氮素積累量和氮素利用效率的計(jì)算：

氮素積累量（mg/株）=煙葉總氮含量（%，g/100 g）×煙葉干質(zhì)量（g/株）×1 000

氮素利用效率（NUE，mg DW/mg N）=煙葉干物質(zhì)量/煙葉氮素積累量

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和Origin pro 9.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖；使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行方差分析，用LSD 法對(duì)煙葉干物質(zhì)積累量、色素含量、NRA、總氮和氮素積累量等指標(biāo)進(jìn)行方差分析和方差齊性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鉬酸鈉處理對(duì)煙葉干物質(zhì)積累的影響

由圖1 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內(nèi)，施用鉬酸鈉后煙葉干物質(zhì)積累均呈增加趨勢(shì)，且隨鉬酸鈉濃度增加煙葉干物質(zhì)積累呈升高趨勢(shì)。其中，0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后，煙葉干物質(zhì)積累量較對(duì)照分別提高7.83%、16.87%、30.72%和30.12%，其中1.0%和2.0%鉬酸鈉處理效果最佳。這說明施用1.0%和2.0%鉬酸鈉對(duì)增加煙葉干物質(zhì)積累和培育壯苗有積極作用。

圖1 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉干物質(zhì)積累量的比較Fig.1 Comparison of dry matter accumulation among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.2 不同濃度鉬酸鈉處理對(duì)煙葉色素含量和光合速率的影響

葉綠素是參與植物葉綠體內(nèi)光合作用的重要色素，能夠捕捉光能并將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，對(duì)煙草的生長發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)形成均具有重要作用［36］。由圖2 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內(nèi)，施用不同濃度鉬酸鈉后，煙葉色素含量和光合速率均呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)；在0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后煙葉色素含量較對(duì)照分別提高1.13%、2.55%、4.25%和3.40%，其中噴施1.0%鉬酸鈉后，煙葉色素含量明顯高于對(duì)照，且差異達(dá)到顯著水平；煙葉光合速率分別較對(duì)照提高0.85%、3.70%、12.81%和12.15%，其中，1.0%和2.0%鉬酸鈉處理后，煙葉光合速率與對(duì)照間差異均達(dá)到顯著水平。本試驗(yàn)中，在0.1%～1.0%鉬酸鈉范圍內(nèi)，煙草色素含量和光合速率均隨鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，但在鉬酸鈉濃度大于1.0%時(shí)煙葉色素含量和光合速率相對(duì)穩(wěn)定，且保持在較高水平，即煙葉光合速率在2.0%鉬酸鈉和1.0%鉬酸鈉處理間差異不顯著。

圖2 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉光合速率和色素含量的比較Fig.2 Comparison of photosynthetic rate and pigment content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.3 不同濃度鉬酸鈉處理對(duì)煙葉總糖和還原糖含量的影響

煙葉中的總糖和還原糖是重要碳水化合物，為煙株氮代謝活動(dòng)提供能量物質(zhì)和碳骨架，對(duì)煙株生長發(fā)育有重要影響［8］。由圖3 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內(nèi)，噴施鉬酸鈉后，煙葉總糖含量變化不大，但煙葉還原糖含量與對(duì)照間差異達(dá)到顯著或極顯著水平；在0.1%～2.0%濃度范圍內(nèi)，隨著施用鉬酸鈉濃度的增加，煙葉還原糖含量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，其中在鉬酸鈉濃度為0.5%、1.0%和2.0%時(shí)，煙葉還原糖含量較對(duì)照分別增加19.69%、23.38%和22.46%?？梢?，噴施鉬酸鈉能夠提高煙苗碳同化能力，促進(jìn)碳水化合物合成，為煙草中還原同化和其他代謝過程提供充足碳源，這有利于降低煙葉硝酸鹽含量和提高煙葉產(chǎn)量［8］。

2.4 不同濃度鉬酸鈉處理對(duì)煙葉酶活性的影響

圖3 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉總糖和還原糖含量的比較Fig.3 Comparison of total sugar and reducing sugar contents among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

NR 是植物體硝酸鹽代謝途徑中的限速酶，具有將硝酸鹽還原成為亞硝酸鹽的作用［32］。鉬是NR 的重要組分，增施鉬肥能夠提高作物NRA，對(duì)促進(jìn)煙株的同化利用有積極作用，對(duì)降低煙株體內(nèi)硝酸鹽含量和提高氮肥利用效率均有良好效果［10］。由圖4 可知，煙葉NRA 隨著鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)。其中，施用鉬酸鈉濃度為0.5%、1.0%和2.0%時(shí)，煙葉NRA較對(duì)照分別提高16.87%、30.72%和30.12%，差異均達(dá)到極顯著水平。施用2.0%鉬酸鈉后，煙葉NRA 與鉬酸鈉濃度為1.0%時(shí)差異不大，說明鉬酸鈉能促進(jìn)苗期白肋煙NRA 的提高，且濃度為1.0%時(shí)效果最佳。

圖4 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉硝酸還原酶活性的比較Fig.4 Comparison of nitrate reductase activity among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.5 不同濃度鉬酸鈉處理對(duì)煙葉可溶性蛋白含量的影響

葉片中可溶性蛋白不僅參與了植物器官的建成，而且很大一部分蛋白是具有調(diào)控生理生化反應(yīng)活性的酶類物質(zhì)，其含量可以反映植物的代謝強(qiáng)度［37］。由圖5 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內(nèi)，隨著鉬酸鈉濃度的增加，煙葉可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，說明施用鉬酸鈉能促進(jìn)氮素同化作用，有利于煙葉可溶性蛋白的形成。其中，在鉬酸鈉為1.0%和2.0%時(shí)，煙葉可溶性蛋白含量較對(duì)照分別提高18.43%和17.84%，差異達(dá)到極顯著水平，且鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時(shí)，煙葉可溶性蛋白含量差異不大。由此可見，在0.1%～2.0%濃度范圍內(nèi)，1.0%鉬酸鈉濃度對(duì)提高煙葉可溶性蛋白含量的作用效果最佳。

圖5 不同濃度鉬酸鈉處理煙葉可溶性蛋白含量的比較Fig.5 Comparison of soluble protein content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.6 不同濃度鉬酸鈉處理對(duì)煙葉總氮含量和氮素積累量的影響

由圖6 可知，在0.1%～2.0%濃度范圍內(nèi)，煙葉總氮含量隨鉬酸鈉濃度的增加呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其中在鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時(shí)，煙葉總氮含量較對(duì)照分別降低10.76%和10.57%，差異達(dá)到顯著水平。在0.1%～2.0%濃度范圍內(nèi)，煙葉氮素積累量隨鉬酸鈉濃度增加而呈現(xiàn)出升高趨勢(shì)，其中在0.1%、0.5%、1.0%和2.0%鉬酸鈉處理時(shí)，煙葉氮素積累量較對(duì)照分別提高3.50%、7.44%、16.59%和16.37%。噴施1.0%鉬酸鈉的煙葉總氮含量下降10.76%，煙葉氮素積累量提高16.59%，說明噴施鉬酸鈉能增加煙葉干物質(zhì)積累量，從而使煙葉氮素積累量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。原因可能是由于鉬酸鈉處理能促進(jìn)煙草干物質(zhì)積累，從而對(duì)總氮含量產(chǎn)生稀釋效應(yīng)，最終導(dǎo)致煙葉總氮含量下降。另一方面也表明，噴施鉬酸鈉能促進(jìn)煙株的碳氮代謝，對(duì)增加煙葉干物質(zhì)積累量和降低硝酸鹽含量有積極作用。

圖6 不同鉬酸鈉濃度處理煙葉總氮含量和氮素積累量的比較Fig.6 Comparison of total nitrogen content and nitrogen accumulation among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.7 不同濃度鉬酸鈉處理對(duì)煙葉 含量和硝態(tài)氮/總氮（-N/TN）的影響

圖7 鉬酸鈉處理煙葉和的比較Fig.7 Comparison of content and content/total nitrogen content among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

2.8 不同濃度鉬酸鈉處理對(duì)煙葉氮素利用效率的影響

由圖8 可知，噴施不同濃度鉬酸鈉均能提高煙葉氮素利用效率，且差異達(dá)到顯著或極顯著水平。與對(duì)照相比，鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時(shí)，煙葉氮素利用效率分別提高12.42%和10.92%，與鉬酸鈉能促進(jìn)煙葉干物質(zhì)積累，提高煙草氮代謝能力有關(guān)。

圖8 鉬酸鈉處理煙葉氮素利用效率的比較Fig.8 Comparison of nitrogen use efficiency among tobacco leaves sprayed with sodium molybdate at different concentrations

3 討論

NR 是高等植物氮同化過程中的關(guān)鍵限速酶，可直接調(diào)節(jié)硝酸鹽的還原，從而調(diào)節(jié)氮代謝，并影響光合碳代謝［38］。Mo 作為NR 的主要組成成分，參與植物的氮代謝和碳代謝過程［39］。本試驗(yàn)條件下，噴施不同濃度鉬酸鈉能不同程度地提高煙葉色素含量和光合速率，與劉利［40］和張紀(jì)利等［41］在草莓和烤煙上的研究結(jié)果一致。其中在鉬酸鈉濃度為1.0%時(shí)，煙葉還原糖含量和干物質(zhì)積累量顯著提高，與色素和光合作用指標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果一致，而總糖含量與對(duì)照間差異不大，與崔國明等［12］和張紀(jì)利等［41］的研究結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)殂f酸鈉處理對(duì)煙葉總糖和還原糖含量的影響有時(shí)間效應(yīng)，煙草生長前期鉬酸鈉處理能促進(jìn)光合作用直接產(chǎn)物（葡萄糖、果糖等還原性糖）的生成，而對(duì)總糖（淀粉等）的影響相對(duì)滯后。這說明鉬酸鈉處理能夠提高煙草光合作用能力，促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累，可能與鉬能提高作物葉綠素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)［42］，而鉬酸鈉參與植物體光合作用的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。此外，噴施不同濃度鉬酸鈉均能提高煙葉NRA 和可溶性蛋白質(zhì)含量，其中鉬酸鈉濃度為1.0%和2.0%時(shí)，煙葉硝酸鹽含量顯著降低，NRA 顯著提高，同時(shí)，在該處理?xiàng)l件下煙草可溶性蛋白質(zhì)含量顯著提高，表明該處理?xiàng)l件下有更多的被吸收利用。鉬酸鈉可以通過提高NR 活性，增強(qiáng)氮素還原同化能力，從而降低煙葉硝酸鹽積累量，與趙靜等［21］、崔國明等［12］研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)結(jié)果中，噴施不同濃度鉬酸鈉能提高煙葉氮素積累量和煙葉干物質(zhì)積累量，可能是由于鉬酸鈉提高氮同化能力，進(jìn)而增強(qiáng)碳同化能力，促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累和植株的生長，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探索。值得關(guān)注的是，白肋煙需氮量高，氮利用效率低，而鉬酸鈉的施用能提高煙葉氮素利用效率，進(jìn)而減少氮肥施用，對(duì)優(yōu)質(zhì)低危害煙葉的生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本試驗(yàn)中，鉬酸鈉濃度為1.0%時(shí)對(duì)苗期白肋煙煙葉總體效果較好，最佳劑量能否作為田間的最佳施用量，有待進(jìn)一步大田試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

在溫度22～28 ℃，光照強(qiáng)度800 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度85%，每12 h 晝夜光照交替的人工氣候室條件下，白肋煙煙苗施用0.1%～2.0%濃度鉬酸鈉后，煙葉色素含量、光合速率、兩糖含量、NRA 和可溶性蛋白含量、煙葉干物質(zhì)積累量均增加，煙葉氮素利用效率明顯提高，且硝酸鹽含量顯著降低。鉬酸鈉處理能提高白肋煙煙葉氮素還原同化能力和碳同化能力，促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累，從而促進(jìn)硝酸鹽還原同化過程，有利于降低煙葉硝酸鹽含量，在白肋煙苗期以1.0%鉬酸鈉處理效果最佳。