一步法合成特異性pH響應(yīng)碳量子點(diǎn)及其發(fā)光機(jī)理研究

高 東,張煜亮,孫 靜,范宏筠

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院,自貢 643000;2.四川大學(xué) 生物材料工程研究中心,成都 610041;3.成都盛訊科技有限公司,成都 610061)

碳量子點(diǎn)作為一類新興的熒光納米材料,引起了人們的廣泛關(guān)注和興趣。由于其優(yōu)異的熒光性能(如可調(diào)熒光、光學(xué)穩(wěn)定性)[1-4],低細(xì)胞毒性[5],良好的生物相容性和溶解性(水相和有機(jī)相)[6-8],易于制備和表面改性等特點(diǎn)[9],碳量子點(diǎn)在生物成像、熒光傳感、光催化和光電裝置等領(lǐng)域展現(xiàn)出誘人的應(yīng)用潛力[7,10]。

碳量子點(diǎn)的熒光特性與其表面狀態(tài)息息相關(guān),因此,絕大多數(shù)碳量子點(diǎn)都表現(xiàn)出依賴 pH的熒光特性,具體表現(xiàn)為碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度隨 pH值的變化而變化[11],這一特性通常歸因于碳量子點(diǎn)表面的質(zhì)子化和去質(zhì)子化效應(yīng)[12]。除熒光強(qiáng)度外,碳量子點(diǎn)的發(fā)射峰位置也會(huì)隨著 pH的變化而改變[12],但這一類變化通常體現(xiàn)為碳量子點(diǎn)固有發(fā)射峰的輕微移動(dòng),到目前為止,尚未見(jiàn)到碳量子點(diǎn)能在不同pH環(huán)境下產(chǎn)生新發(fā)射峰的報(bào)道,尤其是由pH變化引起的紅光發(fā)射。因此,迫切需要對(duì)這類獨(dú)特的pH響應(yīng)行為及其機(jī)理進(jìn)行深入研究。

本研究設(shè)計(jì)了以檸檬酸為碳源,甲酰胺和水為混合溶劑的溶劑熱反應(yīng)體系,可以簡(jiǎn)單地一步合成氮摻雜熒光碳量子點(diǎn),且所得到的碳量子點(diǎn)具有獨(dú)特的pH響應(yīng)性,在強(qiáng)堿性溶液中,會(huì)產(chǎn)生新的不依賴于激發(fā)光的紅光發(fā)射,類似的紅色熒光也出現(xiàn)在富含羥基的醇類溶劑中。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料和試劑

檸檬酸(AR,99.99%)、甲酰胺(AR,98%)、乙醇(AR,≥99.7%)、鹽酸(AR,≥98%)及氫氧化鈉(AR,≥98%)購(gòu)自成都科龍化學(xué)試劑廠。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT) (SIGMA)用于碳量子點(diǎn)細(xì)胞毒性測(cè)試。所用去離子水均為超純水(18.2 Ω)。

1.2 碳量子點(diǎn)的制備

碳量子點(diǎn)的制備過(guò)程如下：首先,將1.5 g檸檬酸溶解在甲酰胺(30 mL)和水(20 mL)的混合溶液中;然后,將所得的均勻透明溶液轉(zhuǎn)移到 100 mL聚四氟乙烯反應(yīng)釜中,在 180 ℃的溫度下反應(yīng) 5 h;待反應(yīng)釜自然冷卻至室溫后,將反應(yīng)所得暗紅色溶液離心(1000 r/min),收集沉淀;用丙酮清洗數(shù)次以除去反應(yīng)殘留物及小分子物質(zhì);然后,用 0.22 μm 的濾膜過(guò)濾;最后,將所得溶液凍干。

1.3 儀器與表征

熒光分光光度計(jì)(F-7000,HITACHI)和紫外分光光度計(jì)(LS-650,Perkin-Elemer)用于表征碳量子點(diǎn)的光學(xué)性質(zhì);透射電子顯微鏡(FEI Tecnai F20)用于表征大小和形貌;傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 6700)和X射線光電子能譜(Kratos Axis Ultra DLD)用于表征表面基團(tuán)和元素組成;X射線衍射(Dandong Fangyuan DX-1000)用于表征碳量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu);拉曼光譜(LabRAM HR)用于表征雜化程度。

1.4 細(xì)胞毒性及成像實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：MTT法檢測(cè)碳量子點(diǎn)的細(xì)胞毒性。將MG63(人體骨肉瘤細(xì)胞)以每孔105個(gè)細(xì)胞接種于 24孔板,將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)培養(yǎng)24 h ,然后加入不同濃度(10、20、50、100 μg/mL)的碳量子點(diǎn)繼續(xù)培養(yǎng)24和72 h,把無(wú)碳量子點(diǎn)組設(shè)為對(duì)照組。培養(yǎng)1和3 d后,細(xì)胞進(jìn)一步用0.5 mg/mL MTT培養(yǎng)4 h,然后,移除加入的溶液,加入二甲基亞礬(DMSO)溶解,搖床振蕩10 min。最后,酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞溶液在波長(zhǎng)490 nm處的吸光度,記錄并處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)：將MG-63細(xì)胞以每孔105個(gè)細(xì)胞接種于 24孔板,將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)培育 24 h。將 100 μg/mL 的碳量子點(diǎn)溶液通過(guò)一層 0.22 μm的濾膜,然后加入到孔板中?；旌衔锱囵B(yǎng)12 h后,去除DMFM培養(yǎng)基,接著用PBS清洗三次以除去剩余的碳量子點(diǎn),最后用熒光顯微鏡(Laika,DMI8)采集圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 形貌與結(jié)構(gòu)表征

圖1(a～b)為樣品的TEM和HRTEM照片,由圖可知,所制備的碳量子點(diǎn)近似于球型,尺寸比較均勻,對(duì)其粒徑進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)其尺寸主要分布在4～5 nm之間(圖1(a)插圖)。高分辨率TEM表明,所制備的碳量子點(diǎn)呈現(xiàn)出明顯的晶格化特點(diǎn),晶面間距經(jīng)測(cè)量約為 0.21 nm,與石墨類材料的[100]晶面相對(duì)應(yīng)[13],這表明所制備的碳量子點(diǎn)具有類似石墨的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步對(duì)碳量子點(diǎn)進(jìn)行 XRD和拉曼光譜表征,以便深入地了解其結(jié)構(gòu)。在 XRD圖譜中,衍射角26°的位置出現(xiàn)了一個(gè)較窄的特征峰(圖1(c)),對(duì)應(yīng)于石墨結(jié)構(gòu)的(002)晶面[14],這表明所制備的碳量子點(diǎn)具有較高的石墨化程度,這與 HRTEM 照片的結(jié)果一致。拉曼光譜顯示在～1300和1530 cm-1處出現(xiàn)了明顯的特征峰(圖1(d)),分別對(duì)應(yīng)于表示無(wú)序碳結(jié)構(gòu)(sp3)的D峰和有序碳結(jié)構(gòu)(sp2)的G峰[15]。此外,在1100和963 cm-1處也出現(xiàn)了明顯的特征峰,分別對(duì)應(yīng)于吡咯環(huán)和吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)[16]。

圖1 碳量子點(diǎn)的 TEM 照片(插圖為粒徑分布圖)(a)、HRTEM照片(b)、XRD圖譜(c)和拉曼光圖譜(d)Fig.1 TEM image (a),HRTEM image (b),XRD pattern (c),and Raman spectrum (d) of the prepared CDs with inset in (a)showing diameter distribution

隨后,用FT-IR和XPS對(duì)所制備的碳量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和表面基團(tuán)進(jìn)行了表征。FT-IR譜圖如圖2(a)所示：1641、1597和 1347 cm-1處的吸收峰分別為C=N/C=O,C=C和C-N的伸縮振動(dòng)峰,這表明所制備的碳量子點(diǎn)具有芳香結(jié)構(gòu),1196和1096 cm-1處的吸收峰是 C-O-C的不對(duì)稱和對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰;3000～3500 cm-1為N-H和O-H的伸縮振動(dòng)峰,表明所制備的碳量子點(diǎn)具有豐富的表面基團(tuán),如氨基、羥基等。圖2(b～c)分別為碳量子點(diǎn)的 XPS高分辨C1s、N1s和O1s圖譜,由圖可知,C1s經(jīng)擬合后可分裂為4個(gè)峰,峰位分別為284.4、285.2、287.1和288.8 eV,分別對(duì)應(yīng)四種含碳結(jié)構(gòu)：C=C、C-N、C-O和C=N/C=O。N1s可分裂為三個(gè)峰,分別為吡啶型氮化物(399.1 eV)、氨基氮(399.6 eV)和吡咯型氮化物(401.3 eV),這一結(jié)果與拉曼光譜一致。O1s分裂為兩個(gè)峰,分別對(duì)應(yīng)C=O(530.7 eV)和C-O (532.4 eV),上述結(jié)果與 FT-IR的表征一致,表明該碳量子點(diǎn)含有豐富的含氮及含氧基團(tuán)。

2.2 光學(xué)性質(zhì)研究

圖2 (a)碳量子點(diǎn)的FT-IR譜圖及高分辨XPS能譜圖;(b) C1s;(c) N1s;(d) O1sFig.2 (a) FT-IR spectrum of prepared CDs,high-resolution XPS spectra of C1s (b),N1s (c) and O1s (d) of prepared CDs

圖3(a)為所得碳量子點(diǎn)的紫外吸收光譜,如圖所示,在250～300 nm出現(xiàn)了一個(gè)窄的吸收,這主要?dú)w因于碳量子點(diǎn)的 sp2區(qū)域的 π-π*躍遷[17];此外,在360 nm處出現(xiàn)了一個(gè)較寬的吸收峰,這是由于碳量子點(diǎn)的表面態(tài)捕獲激發(fā)態(tài)的能量產(chǎn)生的,這一吸收峰通常會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色熒光[18]。所制備的碳量子點(diǎn)具有良好的水溶性,其溶液在紫外燈照射下發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光,與其發(fā)射波長(zhǎng)一致(圖3(a))。圖3(b)是碳量子點(diǎn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光光譜,碳量子點(diǎn)的最佳激發(fā)波長(zhǎng)為360 nm,與其吸收峰位置一致,其對(duì)應(yīng)的發(fā)射峰為448 nm。此外,所制備的碳量子點(diǎn)表現(xiàn)出了典型的依賴于激發(fā)波長(zhǎng)的特征,即發(fā)射波長(zhǎng)隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增大而紅移,且伴隨著熒光強(qiáng)度的降低,這與文獻(xiàn)報(bào)道相符[11,19-21]。

圖3 紫外吸收光譜(插圖為碳量子點(diǎn)在紫外光下的光學(xué)照片) (a)和不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光光譜(b)Fig.3 UV-Vis absorption spectrum of prepared CDs with insets showing optical images of prepared CDs under UV lamp(365 nm) (a) and fluorescent spectra under various excitation wavelengths (b)

2.3 羥基誘導(dǎo)的碳量子點(diǎn)的特異性pH響應(yīng)行為與機(jī)理探討

圖4(a～g)為所制備的碳量子點(diǎn)在不同 pH條件下的熒光光譜。由圖可知,當(dāng) pH值從 1增大到 9時(shí),碳量子點(diǎn)的熒光圖譜基本相同,但其熒光強(qiáng)度在pH從3增至9時(shí)呈線性減弱(圖4(h)),但幅度較小,在紫外燈下光強(qiáng)并沒(méi)有明顯減弱(圖4(i))。但當(dāng)pH增至11和13后,除了在藍(lán)綠光區(qū)域依賴于激發(fā)光的發(fā)射以外,碳量子點(diǎn)在紅光區(qū)域出現(xiàn)了一個(gè)新的發(fā)射峰,該發(fā)射峰隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增大有輕微的紅移,從600 nm紅移至610 nm,且這個(gè)新的發(fā)射峰的強(qiáng)度會(huì)隨著 pH的增大而增強(qiáng),這一變化直觀地體現(xiàn)在紫外燈的照射下,碳量子點(diǎn)溶液的顏色從藍(lán)色變成了粉紅色(圖4(i))。

在不同的 pH條件下,可以看到碳量子點(diǎn)位于藍(lán)綠光區(qū)域的發(fā)射峰基本相同,而在較強(qiáng)的堿性條件下,碳量子點(diǎn)卻產(chǎn)生了獨(dú)特的pH響應(yīng),即在紅光區(qū)域產(chǎn)生了新的發(fā)射峰。通常,藍(lán)綠光區(qū)域的發(fā)射峰是碳量子點(diǎn)固有的,主要來(lái)自于其表面狀態(tài),因而具有依賴于激發(fā)的熒光特征[4,22];而在較強(qiáng)堿性條件下產(chǎn)生的紅光發(fā)射不具有依賴激發(fā)光的熒光發(fā)射,應(yīng)來(lái)自于堿中的氫氧根。由之前的表征可知,該碳量子點(diǎn)表面富含含氮和含氧基團(tuán),因此,堿中含有的大量氫氧根通過(guò)氫鍵的方式結(jié)合在碳量子點(diǎn)表面[23-24],形成新的、穩(wěn)定的發(fā)光中心。值得注意的是,并不是在所有堿性溶液中都會(huì)產(chǎn)生新的紅光發(fā)射,比如在pH等于9時(shí),就沒(méi)有產(chǎn)生(圖4(e)),這很可能是由于在較弱的堿性溶液中,氫氧根的數(shù)量不夠?qū)е碌摹?/p>

為了證明這一猜想,本研究中將碳量子點(diǎn)分散在富含羥基的兩種常見(jiàn)的醇類溶劑甲醇和乙醇中,其熒光圖譜如圖5(a,b)所示。由圖可知,碳量子點(diǎn)在兩種醇類溶劑中的熒光圖譜與其在較強(qiáng)堿性溶液中的熒光圖譜(圖4(f,g))基本相同,在紅光區(qū)域都出現(xiàn)了基本不依賴激發(fā)光的發(fā)射峰,且位置相近,這一結(jié)果初步證明在較強(qiáng)堿性溶液中碳量子點(diǎn)新出現(xiàn)的發(fā)射峰來(lái)源于堿中的氫氧根。而在較弱的堿性溶液中并沒(méi)有出現(xiàn)新的紅光發(fā)射是因?yàn)樵谠摋l件下溶液中的氫氧根數(shù)量不夠。

為了進(jìn)一步證明這一假設(shè),將甲醇和水按不同的比例進(jìn)行混合來(lái)改變混合溶液中羥基的含量,結(jié)果如圖6所示。按甲醇的含量設(shè)的三個(gè)比例(體積比),分別為75%甲醇溶液、50%甲醇溶液和25%甲醇溶液。由圖可知,當(dāng)甲醇的含量超過(guò)50%時(shí)(圖6(a,b)),碳量子點(diǎn)的熒光譜圖中均出現(xiàn)了新的紅光發(fā)射峰,但是,當(dāng)混合溶劑中甲醇的含量降到 25%時(shí),碳量子點(diǎn)的熒光譜圖中沒(méi)有出現(xiàn)新的發(fā)射峰,這可以直觀地從熒光照片中看出,如圖6(d)所示,在紫外燈的照射下,較高甲醇含量的溶液發(fā)射的是粉紅色熒光,且甲醇含量越高,熒光強(qiáng)度越高;而 25%甲醇溶液發(fā)出的是藍(lán)色熒光。這一結(jié)果表明,溶液中羥基含量的多少直接決定了紅光區(qū)域的發(fā)射是否會(huì)產(chǎn)生,羥基的含量需要達(dá)到一定水平才能讓碳量子點(diǎn)表面形成新的發(fā)光中心從而產(chǎn)生新的紅光發(fā)射。同時(shí)這一結(jié)果也證明了堿性強(qiáng)弱與紅光發(fā)射之間的聯(lián)系。

2.4 碳量子點(diǎn)的應(yīng)用

圖4 不同pH條件下碳量子點(diǎn)的熒光光譜(a～g)、pH值與碳量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的關(guān)系(EX=360 nm)(h)和不同pH值的碳量子點(diǎn)溶液在紫外燈下的熒光照片(i)Fig.4 Fluorescent spectra of as-prepared CDs with different pH values under various excitation wavelengths (a-g),fluorescent intensity at different pH under excitation of 360 nm (h) and optical images of prepared CDs with different pH under UV lamp (365 nm) (i)

圖5 所制備的碳量子點(diǎn)在甲醇中的熒光光譜(a)和所制備的碳量子點(diǎn)在乙醇中的熒光光譜(b)Fig.5 Fluorescent spectra of prepared CDs in methanol (a) and ethanol (b) under various excitation wavelengths

為探究所獲得的碳量子點(diǎn)可能的生物應(yīng)用,本研究首先檢測(cè)了其細(xì)胞毒性,如圖7(a)所示,細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)正常增殖,碳量子點(diǎn)的存在并未顯著降低細(xì)胞的增殖,表明所制備的碳量子點(diǎn)具有較低的細(xì)胞毒性。從將碳量子點(diǎn)與MG-63細(xì)胞共培養(yǎng)的熒光顯微鏡照片可以看出,碳量子點(diǎn)可被 MG-63細(xì)胞攝取并分布在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞在 405、488和543 nm激發(fā)下分別發(fā)出藍(lán)光、綠光和紅光。這一結(jié)果表明該碳量子點(diǎn)可用于細(xì)胞標(biāo)記,顯示出在生物成像領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖6 碳量子點(diǎn)在不同比例甲醇和水混合溶液中的熒光圖譜Fig.6 Fluorescent spectra of prepared CDs in the mixed solution of methanol and water at methanol concentration of 75% (a),50% (b) and 25% (c) under various excitation wavelengths,and their optical images under UV lamp excitation (365 nm) (d)

圖7 碳量子點(diǎn)對(duì)MG-63細(xì)胞活性沒(méi)有顯著影響(a),所標(biāo)記的MG-63細(xì)胞在紫外(b)、藍(lán)光(c)和綠光(d)照射下的熒光照片F(xiàn)ig.7 Cell viability (a) and fluorescence images of MG-63 cells excited by UV (b),blue (c),and green light (d)

3 結(jié)論

本研究采用檸檬酸為碳源,甲酰胺和水為混合溶劑,通過(guò)溶劑熱的方式合成了氮摻雜的碳量子點(diǎn)。該碳量子點(diǎn)具有良好的水溶性且在水中具有明亮的藍(lán)光發(fā)射,同時(shí)細(xì)胞毒性低,因此可以作為熒光探針應(yīng)用于細(xì)胞成像領(lǐng)域。此外,該碳量子點(diǎn)還具有獨(dú)特的pH響應(yīng),即在較強(qiáng)堿性溶液中,碳量子點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生新的不依賴于激發(fā)的紅光發(fā)射峰,在紫外燈的照射下,其溶液也從明亮的藍(lán)色變成粉紅色,但值得注意的是,隨著堿性的逐漸減弱,紅光發(fā)射會(huì)消失。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明,同樣的紅光發(fā)射也出現(xiàn)在富含羥基的醇類溶劑中,且隨著醇類溶劑含量的逐漸減少,產(chǎn)生的紅光發(fā)射同樣會(huì)消失。這些結(jié)果表明,碳量子點(diǎn)新產(chǎn)生的紅光發(fā)射來(lái)自氫氧根或羥基,氫氧根或羥基可以通過(guò)氫鍵與碳量子點(diǎn)表面的含氮及含氧基團(tuán)結(jié)合,形成新的、穩(wěn)定的發(fā)光中心。