超聲波輔助提取羊奶果提取物中總黃酮及其抗氧化性研究

李揚 邵永明

摘 要：以羊奶果為原料，采用超聲波輔助法，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化羊奶果中總黃酮的提取工藝及其提取物體外抗氧化效果，結(jié)果表明，最佳工藝條件為：超聲乙醇提取溫度40.0℃、液料比5∶1、超聲波輔助提取時間30min，超聲波輔助提取功率167.0W，在此條件下，羊奶果中總黃酮的提取率可達到25.0046g·kg-1。在不同油脂中添加梯度濃度的總黃酮提取物，對DPPH自由基的清除，羊奶果提取物均具有較強抗氧化性。

關(guān)鍵詞：羊奶果;總黃酮;超聲輔助乙醇法;響應(yīng)面

中圖分類號 TS411文獻標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）22-0019-04

Ultrasonic Assisted Extraction of Total Flavonoids from Sheep Milk Fruit Extract and its Antioxidant Activity

Li Yang1 et al.

（1Jilin Institute of Agricultural Science and Technology，Jilin 132001，China）

Abstract：In the ultrasonic assisted extraction of total flavonoids from sheep milk fruit，the ultrasonic extraction temperature was 40.0 °C，the liquid-to-liquid ratio was 5：1，the ultrasonic assisted extraction time was 30 min， and the ultrasonic assisted extraction power was 167.0 W. The reliability of the condition was continuously carried out in three parallel experiments. The total flavonoids in goat milk were extracted by the above optimal conditions，and the average extraction amount of total flavonoids in goat milk was 25.0046g·kg-1. Theoretically，goat milk was obtained. The extraction amount of total flavonoids was 25.7581 g·kg-1，and the relative error between the two was 0.29%. The antioxidant effect of total flavonoids extract from sheep milk fruit in vitro was studied. The antioxidant effect of total flavonoids extract with gradient concentration in different oils and oils was observed，and the scavenging effect on DPPH free radical showed that sheep milk fruit extract had strong antioxidant activity.

Key words：Sheep milk fruit;Total flavonoids;Ultrasound-assisted ethanol method;Response surface

羊奶果（Elueagnus Confetta Koxh），又名牛虱子果、羊山咪樹、長匐莖胡頹子[1]，屬胡頹子科、胡頹子屬、木本多年生常綠植物。其形態(tài)呈橢圓形，顏色由綠色變到紅色，由生至熟，成熟的顏色呈現(xiàn)鮮紅色，體積略大于鴿卵。羊奶果本身是一種營養(yǎng)價值非常高的漿果類的植物，成熟羊奶果的含水量在90%以上，粗蛋白約占2.5%，總糖量含量約占5.2%（其中還原糖占99.2%），粗脂肪含量約占2.9%，總酸量含量約占1.46%;總黃酮含量約占0.45%，新鮮羊奶果每100g中含鈣量大約20.3mg，含類胡蘿卜素量大約3.16mg，羊奶果味道本身帶酸、帶澀，并含有大量的溶解酶，所以，飯后食用羊奶果，對食物中的含有的蛋白質(zhì)有很好的消化作用。羊奶果原產(chǎn)熱帶地區(qū)（南亞、西亞等），現(xiàn)在分布廣泛，早產(chǎn)量產(chǎn)，在我國的云南、貴州、廣西西部等地區(qū)，主要以野生為主[2]。在廣西山圩農(nóng)場周圍人工試種獲得試驗成功，但受深加工條件的限制至今還未能夠量產(chǎn)[2]。因此，開發(fā)和探究羊奶果中各微量元素含量工藝及其復(fù)合產(chǎn)品深加工，對發(fā)展羊奶果生產(chǎn)和應(yīng)用具有非常重要的現(xiàn)實的意義3]?？傸S酮又叫黃堿素[4]、黃酮體、類黃酮，其主要以化合物的形式，廣泛存在于自然界的植物中，屬于次生代謝物[8]。羊奶果中總黃酮是一類同分異構(gòu)體、氫化物、還原產(chǎn)物等[5]的黃色色素。在植物中，主要與糖類結(jié)合，形成糖苷或者碳水化合物，有些也以游離形式存在。它主要的功效有：抗衰老、抗疲勞、抗癌、抗腫瘤、降血脂、降血清膽固醇、增加機體免疫等作用。

本文采用超聲波輔助乙醇提取法提取羊奶果中的總黃酮，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化羊奶果中總黃酮提取試驗條件[14]，探究最佳的工藝條件，為羊奶果中總黃酮的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑 羊奶果、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、乙醇、無水氯化鈣、檸檬酸鈉。

1.2 儀器與設(shè)備 UV-2600 紫外可見分光光度計、H2050R-1離心機、超聲波清洗機。

1.3 方法

1.3.1 總黃酮的定性檢驗方法 鐵離子反應(yīng)，若提取液呈墨綠色，則表明有黃酮存在。

1.3.2 總黃酮的定量分析 （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：用紫外可見分光光度計測定其吸光度。記錄數(shù)據(jù)，并以蘆丁質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=11.314x-0.0004，R2=0.9888，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.02～0.10mg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

（2）準(zhǔn)確度：試驗數(shù)據(jù)所得的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.12%<2.0%。

（3）線性：試驗線性即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗結(jié)果顯示，y=11.314x-0.0004，R2=0.9888，線性良好。

（4）羊奶果中總黃酮化合物得率的計算：取各自條件下所提取得到的羊奶果總黃酮樣液，測定其吸光度，按以下公式計算總黃酮的得率：

得率（%）=×100CV/M×100 （1）

上式中：C為提取液濃度g/mL，V為提取液原始體積mL，M為所取羊奶果粉質(zhì)量g。

1.3.3 體外抗氧化效果測試 （1）DPPH自由基清除能力測定：

DPPH或 ABTS自由基清除率（%）=[（A0-（AX-AX0））/A0]×100 （2）

1.3.4 油脂抗氧化性研究 在油脂中分別加入不同濃度的總黃酮提取物和BHT，混合均勻，將油脂放入65℃的烘箱中，每隔一定時間觀察油脂的氧化效果及感官狀態(tài)變化情況，設(shè)置空白對照。

1.3.5 羊奶果中總黃酮對黑腹果蠅SOD和GSH-Px活力的影響 為了進一步評價羊奶果中總黃酮的抗氧化能力，在自由基清除試驗的基礎(chǔ)上，采用果蠅模型對異黃酮的體內(nèi)抗氧化活性[22]進行研究。

1.3.6 工藝流程 羊奶果→預(yù)處理→150℃恒溫干燥→切塊→乙醇溶液浸泡同時超聲處理→過濾→上清液→濃縮→備用。

1.3.7 操作要點 將洗凈的羊奶果切絲，放于烘箱中，調(diào)節(jié)溫度至150℃，時間設(shè)定為12h;將烘干的羊奶果絲用小刀切為0.25mm×0.25mm的小塊，于干燥處備用;取羊奶果果粉置于50mL的燒杯中，同時加入70%的乙醇溶液，置于試驗室超聲儀中，調(diào)整波長，定時10分鐘后取出;將經(jīng)過超聲乙醇處理的羊奶果小塊粗濾，去掉濾渣;將濾液置于UV-2601型紫外可見分光光度計中測定濾液的吸光度，并記錄試驗數(shù)據(jù)。

1.3.8 單因素試驗 針對羊奶果中總黃酮的提取條件，固定其他條件下，分別從超聲溫度、液料比超聲提取時間、超聲波功率4個方面對羊奶果中總黃酮提取率的影響進行研究，取新鮮羊奶果進行試驗，分別確定超聲溫度30～50℃、液料比3∶1～7∶1、超聲提取時間20～40min、超聲波功率90～210w等進行單因素試驗

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲波輔助乙醇提取溫度 進行提取溫度分別為30、35、40、45、50℃的單因素試驗，經(jīng)過3次平行實驗，得出超聲波輔助提取溫度在40℃時得率更大，故選擇35、40、45℃為響應(yīng)面試驗超聲輔助提取溫度的3個水平。

2.1.2 液料比 進行液料比分別為3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1的單因素試驗，經(jīng)過3次平行實驗，得出液料比在5∶1時得率更大，故選擇4∶1、5∶1、6∶1為響應(yīng)面試驗液料比的3個水平。

2.1.3 超聲波輔助 進行超聲波輔助提取時間分別為20、25、30、35、40min的單因素試驗，經(jīng)過3次平行實驗，得出超聲波輔助提取時間在30min時得率更大，故選擇25、30、35min為響應(yīng)面試驗超聲波輔助提取時間的3個水平。

2.1.4 超聲波輔助提取功率 進行超聲波輔助提取功率分別為90、120、150、180、210W的單因素試驗，經(jīng)過3次平行實驗，得出超聲波輔助提取功率在150（W）時得率更大，故選擇25、30、35（W）為響應(yīng)面試驗超聲波輔助提取功率的3個水平。

2.2 利用響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果 綜合考慮單因素試驗所得結(jié)果，以提取溫度（℃）、液料比、超聲輔助提取時間（min）、超聲功率（W）作為響應(yīng)因素，分別記作A、B、C、D。以總黃酮化合物得率（g·kg-1）作為響應(yīng)值，記作Y，具體見表1。

考慮到超聲輔助提取時間達到1h時，羊奶果中總黃酮化合物的溶出基本達到平衡，對得率影響不大，結(jié)合Box-Behnken8.0.6軟件和Box-Behnken中心試驗設(shè)計原理[18-20]，以羊奶果總黃酮得率為響應(yīng)值，設(shè)計五因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

利用DesignExpert8.0.6對數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，方差分析及顯著性檢驗，以總黃酮化合物的得率作為目標(biāo)函數(shù)，對A，B，C，D的二次多項回歸方程為：

Y=23.76+0.27×A+0.36×B+0.47×C+0.21×D-0.36×A×A-0.37×A×C+0.061×A×D+0.13×B×C+0.68×B×D+0.12×C×D+0.059×A2-0.53×B2-0.38×C2-0.42×D2

將上述結(jié)果做顯著性檢驗，如表3所示：

方程的方差分析結(jié)果和回歸模型各項系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果和見表3。由表3可以看出，該回歸模型的P=0.0003，遠小于0.01，證明此數(shù)據(jù)分析結(jié)果的顯著性為極顯著，擬合模型較好，該試驗的設(shè)計合理，誤差較小，所以可以用此數(shù)學(xué)方程代替實驗結(jié)果，各個因素對羊奶果中總黃酮的影響排序為：D>B>A>C，交互項對羊奶果中總黃酮類影響排序為AD>CD>BC>AB>AC>BD，二次項對羊奶果中總黃酮影響排序為：A>C>D>B。

2.2.2 交互作用對羊奶果中總黃酮得率影響的響應(yīng)面分析 交互作用對羊奶果中總黃酮得率的影響響應(yīng)面分析見圖2。最佳試驗條件為：超聲波輔助提取溫度為39.9℃，液料比為4.8∶1，超聲時間為29.6min，超聲波輔助提取功率為166.8W;為使得試驗操作更為方便，最佳條件設(shè)定為：超聲乙醇提取溫度40.0℃，液料比為5∶1，超聲波輔助提取時間為30min，超聲波輔助提取功率為167.0W;為檢驗上述所得最佳試驗條件的可靠性，連續(xù)做3組平行試驗，利用上述最佳工藝條件提取羊奶果中總黃酮，得到羊奶果中總黃酮的平均提取量為25.0046g·kg-1，理論上可得到羊奶果中總黃酮的提取量為25.7581g·kg-1，二者之間相對誤差為0.29%。

2.3 抗氧化效果

2.3.1 對DPPH自由基清除的能力 測定羊奶果中總黃酮提取物清除自由基的能力，以抗壞血酸VC作對照，結(jié)果見圖3。各個不同溶液環(huán)境下，DPPH自由基濃度升高，各相對其清除率均有不同程度增長，同等濃度條件下抗壞血酸清除率比羊奶果總黃酮提取物的清除率好。但抗壞血酸在濃度達到0.06mg·mL-1時達到穩(wěn)定，而羊奶果中總黃酮提取物在0.08mg·mL-1清除DPPH自由基效果維持穩(wěn)定。

2.3.2 抑制油脂氧化的效果 對試驗油脂進行觀測發(fā)現(xiàn)油脂顏色及氣味隨時間發(fā)生不同程度的變化，空白組在2h以后油脂顏色加深，并在6h以后出現(xiàn)輕微哈喇味，各相油脂氧化速度明顯不同。羊奶果中總黃酮提取物具有較強的對油脂氧化的抑制能力，且隨添加濃度上升油脂氧化速度降低，但在同樣條件下比BHT作用效果相對較弱。

2.3.3 對黑腹果蠅SOD和GSH-Px活力的影響 用含有0.5mg/g羊奶果總黃酮提取物的培養(yǎng)基飼喂果蠅，可使其SOD和GSH-Px活力顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）升高，表明一定劑量的總黃酮提取物能夠增強果蠅清除體內(nèi)活性氧的能力。

3 結(jié)論

最佳條件設(shè)定為：超聲乙醇提取溫度40.0℃，液料比為5∶1，超聲波輔助提取時間為30min，超聲波輔助提取功率為167.0W;為檢驗上述所得最佳試驗條件的可靠性，連續(xù)做三組平行試驗，利用上述最佳工藝條件提取羊奶果中總黃酮，得到羊奶果中總黃酮的平均提取量為25.0046g·kg-1，理論上可得到羊奶果中總黃酮的提取量為25.7581g·kg-1，兩者之間相對誤差為0.29%。低、高劑量組黑腹果蠅的SOD和GSH-Px活力均有所升高。用含有0.5mg/g羊奶果總黃酮提取物的培養(yǎng)基飼喂果蠅，可使其SOD和GSH-Px活力顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）升高，表明一定劑量的總黃酮提取物能夠增強果蠅清除體內(nèi)活性氧的能力。

參考文獻

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（責(zé)編：王慧晴）