肝癌細(xì)胞異位過表達(dá)IL-12的抗腫瘤作用研究①

穆永亮 趙華俊 張 建 韓秋菊

(山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥物學(xué)研究所，濟(jì)南 250012)

腫瘤微環(huán)境是癌細(xì)胞賴以生存和維持惡性增殖的內(nèi)環(huán)境，呈現(xiàn)明顯的免疫抑制狀態(tài)[1]。利用細(xì)胞因子增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答、破壞腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸狀態(tài)，成為腫瘤生物治療的重要策略之一。其中，IL-12尤為引人關(guān)注，被認(rèn)為具有應(yīng)用于臨床治療腫瘤的潛力[2,3]。

IL-12是由 p35、p40 兩個亞基共同組成的異源二聚體，主要由樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞分泌，能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的激活，在臨床上已被用于黑色素瘤、腎細(xì)胞腺癌等多種疾病的輔助治療[4]。然而，在臨床應(yīng)用過程中，人們逐漸關(guān)注到全身使用IL-12治療可引起明顯的毒副作用，并且IL-12半衰期較短，停藥后療效迅速消失[5,6]。

多年來，研究者致力于改造IL-12或者通過改變給藥途徑/部位以降低毒副作用。有科學(xué)家通過刪除IL-12單鏈的N末端對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，利用靶向腫瘤的溶瘤腺病毒作為載體，在胰腺癌治療中取得了良好的效果，且沒有顯著的毒副作用[7]。也有研究發(fā)現(xiàn)，瘤內(nèi)注射表達(dá)IL-12的質(zhì)粒(pIL-12)能夠控制IL-12的局部表達(dá)，并激活腫瘤微環(huán)境中免疫應(yīng)答，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用，并且降低了IL-12的副作用。2017年FDA批準(zhǔn)pIL-12為治療不可切除轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的罕見藥[8]。

本研究中，我們首先將mIL-12-PsecTag過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠來源的肝癌細(xì)胞系Hepa1-6中，觀察肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的變化，進(jìn)一步利用小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探索過表達(dá)IL-12的抗腫瘤作用和免疫激活作用，為進(jìn)一步探討IL-12基因治療肝癌提供必要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司。鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胰酶購自Sagon上海股份有限公司；新生胎牛血清購自天津?yàn)s洋科技有限公司；mIL-12-PsecTag過表達(dá)質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；mIL-12 ELISA 試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)公司；LipoTM2000脂質(zhì)體購自Invitrogen；Trizol購自Invitrogen公司；Sybr Green Mix購于Roche生物有限公司；CCK-8和總蛋白提取試劑盒購自碧云天生物公司；引物由上海派森諾生物科技股份有限公司；anti-CD3、anti-NK1.1、anti-CD8、anti-IFN-γ、anti-TNF-α、anti-PD-L1、anti-CD69等抗體購自eBioscience 公司；pSTAT1、STAT1抗體及HRP羊抗兔二抗均購自CST公司。

1.2方法

1.2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板中(1×106個)，培養(yǎng)過夜。次日，更換無血清培養(yǎng)基。將2 μg質(zhì)粒加至250 μl無血清培基中混勻，同時將 4 μl Lipo-2000脂質(zhì)體加至另外250 μl無血清培基中，輕吹混勻，室溫靜置5 min。將DNA懸液與脂質(zhì)體懸液輕輕混勻，靜置20 min，將復(fù)合物均勻加入每孔中，培養(yǎng)4 h后更換含10%血清的培養(yǎng)基。

1.2.2CCK-8法檢測細(xì)胞增殖 接種狀態(tài)良好的細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106個/孔(6孔板)；次日，分別轉(zhuǎn)染空載體和IL-12過表達(dá)載體；轉(zhuǎn)染 6 h 后，消化細(xì)胞重新接種到96孔板，6 000個/孔，培養(yǎng)不同時間后棄掉上清，加入10%CCK-8溶液100 μl，培養(yǎng)4 h；在450 nm處測定吸光度，并計算細(xì)胞活力。

1.2.3熒光定量PCR 參照Trizol說明書，提取細(xì)胞總RNA。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR反應(yīng)。鼠IL-12上游引物為:GGTGTCTTAGCCAG-TCC，下游引物為CAGCTCCCTCTTCTTGT；IL-12Rβ2上游引物為CATGTTGCTGATGTGGGGGAAT，下游引物為ACTTATGCACTTGAGCGGGGGG。

1.2.4Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 轉(zhuǎn)染mIL-12-PsecTag過表達(dá)載體或?qū)φ湛蛰d體后，收集Hepa1-6細(xì)胞上清，將其加入Transwell下室。在觀察腫瘤細(xì)胞的遷移能力時，上室加入未經(jīng)處理的Hepa1-6細(xì)胞，共培養(yǎng)12 h；在觀察異位過表達(dá)IL-12對淋巴細(xì)胞的募集作用實(shí)驗(yàn)中，上室加入脾細(xì)胞，共培養(yǎng)12 h，觀察脾細(xì)胞的募集數(shù)量。

1.2.5Western blot檢測STAT1活化 按照上述方法轉(zhuǎn)染空載體和IL-12過表達(dá)載體，提取總蛋白；按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟完成SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；將pSTAT-1和STAT1抗體按照1∶1 000孵育過夜；次日洗滌3次；二抗(1∶5 000)孵育1 h；洗滌3次 后進(jìn)行顯影及結(jié)果分析。

1.2.6小鼠肝臟單個核細(xì)胞分離 處死小鼠，剝離肝臟組織，離心(50 g,1 min)去除肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，將上層液轉(zhuǎn)移至新的50 ml離心管中；兩次離心(400 g,6 min)后棄掉上清，底層細(xì)胞沉淀用40% Percoll溶液重懸，離心；加入紅細(xì)胞裂解液，4℃裂解10 min；加1×PBS離心，懸起底層細(xì)胞，于4℃放置備用。

1.2.7FACS檢測細(xì)胞中蛋白水平 每個流式管中加入20 μl大鼠血清進(jìn)行封閉；加入適量不同抗體，并設(shè)置單標(biāo)對照、同型對照，4℃放置1 h。離心洗滌兩次 (400 g,6 min)；棄掉上清，每管加入200 μl PBS將底層細(xì)胞懸起，于流式儀上進(jìn)行檢測。對于胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測，經(jīng)固定、穿膜后，標(biāo)記IFN-γ、TNF-α抗體，孵育2 h后，洗滌2次，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.8荷瘤小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 選取6周齡的雄性C57BL/6小鼠，每只小鼠皮下注射2×106個Hepa1-6細(xì)胞。荷瘤1周后，瘤內(nèi)注射PsecTag-mIL-12載體，每3天注射1次，每次15 μg，共計4次。3周后，處死小鼠，取腫瘤組織并稱重；FACS檢測瘤內(nèi)淋巴細(xì)胞活化水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，兩組數(shù)據(jù)間比較采用配對t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

位于一六多金屬礦田南部、天門坳—牛公錐西主干斷裂中段西側(cè)、梅子沖銀鉛鋅礦床南約4km處(圖1)。赤老頂銻礦歷史悠久，于清末始被發(fā)現(xiàn)和開采，礦體主要呈似層狀、透鏡狀賦存于天子嶺組內(nèi)的硅化層或硅化斷裂破碎帶中，主礦體賦礦標(biāo)高為409～134m，目前最深開采標(biāo)高至+170m左右。斷裂發(fā)育，具有近SN、NNE、NNW、NW、近EW及NE向等多組斷裂，其中近SN向、NNE向、NNW向組與礦化關(guān)系較密切。圍巖蝕變主要為硅化、方解石化。區(qū)內(nèi)未見巖體出露。

2 結(jié)果

2.1mIL-12-PsecTag載體在肝癌細(xì)胞中有效表達(dá)IL-12 我們利用Lipo2000脂質(zhì)體將mIL-12-PsecTag過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6細(xì)胞，進(jìn)一步檢測IL-12基因和蛋白水平。如圖1A所示，與PsecTag空載體組相比，PsecTag-mIL-12組IL-12的mRNA水平顯著升高。進(jìn)一步用ELISA試劑盒對細(xì)胞上清中IL-12含量進(jìn)行檢測也觀察到同樣的結(jié)果(圖1B)。以上結(jié)果證實(shí)，PsecTag-mIL-12載體可以在小鼠肝癌細(xì)胞中有效表達(dá)。

圖1 mIL-12-PsecTag載體在肝癌細(xì)胞中有效表達(dá)IL-12Fig.1 Ectopic expression of IL-12 by Hepa1-6 cells transfected with mIL-12-PsecTag vectorNote:**.P<0.01.

2.2異位過表達(dá)IL-12能抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖和遷移 為了證明異位過表達(dá)IL-12能夠通過自分泌形式影響肝癌細(xì)胞，我們首先對Hepa1-6細(xì)胞IL-12受體進(jìn)行了檢測。如圖2A所示，Hepa1-6細(xì)胞表達(dá)較高水平IL-12Rβ2，且mIL-12過表達(dá)能夠顯著提高其表達(dá)水平。然后，我們觀察異位過表達(dá)IL-12對肝癌細(xì)胞惡性特征的直接影響。如圖2B結(jié)果所示，轉(zhuǎn)染PsecTag-mIL-12能夠抑制Hepa1-6細(xì)胞增殖。接下來，利用Transwell的方法檢測PsecTag-mIL-12載體對Hepa1-6細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載體組相比，過表達(dá)IL-12組Hepa1-6細(xì)胞遷移能力明顯下降，且侵襲數(shù)量顯著降低(圖2C、D)。以上結(jié)果說明，異位過表達(dá)IL-12能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程。

圖2 異位過表達(dá)IL-12能抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲Fig.2 Ectopic expression of IL-12 could inhibit prolifera-tion,migration and invasion of Hepa1-6 cellsNote:*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3異位過表達(dá)IL-12能抑制肝癌細(xì)胞負(fù)調(diào)分子的表達(dá) 腫瘤細(xì)胞能夠通過多種方式來逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，而免疫抑制通路在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮了重要作用[1]。因此，我們對肝癌細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)細(xì)胞因子TGF-β和免疫檢查點(diǎn)分子PD-L1的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。如圖3A所示，與空載體組相比，Hepa1-6細(xì)胞過表達(dá)PsecTag-mIL-12后，其上清中TGF-β含量顯著降低。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IL-12后Hepa1-6細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)水平明顯下調(diào)(圖3B)。以上結(jié)果提示，過表達(dá)IL-12能顯著抑制肝癌細(xì)胞免疫負(fù)調(diào)分子的表達(dá)。

圖3 異位過表達(dá)IL-12能抑制肝癌細(xì)胞負(fù)調(diào)分子的表達(dá)Fig.3 Ectopic expression of IL-12 could decrease expression of inhibitory molecules in HCCNote:*.P<0.05.

2.4肝癌細(xì)胞過表達(dá)IL-12能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的募集 我們進(jìn)一步觀察Hepa1-6細(xì)胞異位過表達(dá)IL-12對脾淋巴細(xì)胞的募集作用。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空載體組相比，過表達(dá)PsecTag-mIL-12的Hepa1-6細(xì)胞上清所募集的脾細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖4A、B)。這一結(jié)果提示，異位過表達(dá)IL-12在促進(jìn)淋巴細(xì)胞募集的同時，有可能對淋巴細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

圖4 肝癌細(xì)胞異位過表達(dá)IL-12能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的募集Fig.4 Ectopic expression of IL-12 in HCC could promote recruitment of lymphocytes in vitroNote:*.P<0.05.

2.5過表達(dá)IL-12能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞活化 為了進(jìn)一步分析PsecTag-mIL-12載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞對所招募的免疫細(xì)胞亞群的影響，我們利用不同處理組的Hepa1-6細(xì)胞上清孵育脾細(xì)胞，然后利用流式細(xì)胞術(shù)的方法分析不同淋巴細(xì)胞亞群活化狀態(tài)。結(jié)果顯示，與空載體組相比，IL-12過表達(dá)組肝癌細(xì)胞上清能顯著提高CD8+T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平(圖5A)，并且CD8+T細(xì)胞中IFN-γ和TNF-α分泌亦有顯著升高(圖5B、C)。我們進(jìn)一步利用Western blot方法檢測上述小鼠脾單個核細(xì)胞中STAT1的活化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空載體組相比，IL-12過表達(dá)組肝癌細(xì)胞上清處理的脾細(xì)胞中磷酸化STAT1水平顯著增加(圖5D)。以上結(jié)果表明，過表達(dá)IL-12能夠激活STAT1信號通路并誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞活化。

圖5 肝癌細(xì)胞異位過表達(dá)IL-12能激活STAT1信號通路促進(jìn)CD8+T細(xì)胞活化Fig.5 Ectopic expression of IL-12 in HCC could IL-12 could activate T cells via STAT1 signalNote:*.P<0.05.

2.6IL-12載體能夠激發(fā)荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤免疫應(yīng)答 最后，我們建立移植腫瘤模型，通過瘤內(nèi)注射IL-12載體的方式觀察抗腫瘤作用。結(jié)果顯示，與空載體組相比，PsecTag-mIL-12治療組腫瘤體積明顯減小，腫瘤生長速度顯著降低(圖6A、B)。進(jìn)一步分析腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的活化水平，如圖6C所示，PsecTag-mIL-12治療組瘤內(nèi)CD8+T細(xì)胞中CD69表達(dá)水平顯著上調(diào)，且CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的量明顯增加。我們還觀察到，PsecTag-mIL-12治療后，腫瘤內(nèi)NK細(xì)胞CD69表達(dá)水平也發(fā)生顯著升高(圖6D)。以上結(jié)果說明，瘤內(nèi)注射IL-12表達(dá)載體能夠活化微環(huán)境中免疫細(xì)胞，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖6 瘤內(nèi)注射IL-12能抑制小鼠體內(nèi)腫瘤生長并有效活化免疫細(xì)胞Fig.6 Intratumoral injection of IL-12 could inhibit tumor growth and activate immune cells in mice bearing Hepa1-6 cells Note:*.P<0.05.

3 討論

改善肝癌微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)對于提高抗腫瘤效果具有重要的作用，其中增加抗腫瘤免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子是促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答的策略之一?；贗L-12在誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮非常重要的作用[2]，并考慮到系統(tǒng)應(yīng)用IL-12的副作用，本研究中我們構(gòu)建了PsecTag-mIL-12過表達(dá)載體，擬通過腫瘤細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的途徑激活免疫系統(tǒng)，研究其抗肝癌的作用。我們發(fā)現(xiàn)，由于肝癌細(xì)胞表達(dá)IL-12受體，過表達(dá)的IL-12可以通過自分泌的形式與肝癌細(xì)胞表面受體結(jié)合，進(jìn)而激活胞內(nèi)信號通路，最終影響細(xì)胞增殖和遷移(圖1和圖2)。也有研究利用電轉(zhuǎn)IL-12載體的方式在乳腺癌、黑色素瘤中進(jìn)行治療，同樣也觀察到顯著的抗腫瘤效果[9,10]。

TGF-β不僅能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長和分化，還能夠通過多種途徑幫助癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊[11,12]。我們觀察到，肝癌細(xì)胞異位過表達(dá)IL-12能夠降低TGF-β的表達(dá)(圖3A)。此外，通過瘤內(nèi)注射腺病毒IL-12載體在乳腺癌模型中也觀察到類似的現(xiàn)象，且TGF-α介導(dǎo)的Treg細(xì)胞分化亦受到顯著抑制[13]。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，我們將在肝癌模型中觀察過表達(dá)IL-12對Treg細(xì)胞分化及功能的影響。

腫瘤微環(huán)境中高表達(dá)的PD-L1與腫瘤的免疫耐受密切相關(guān)，其通過與PD-1結(jié)合來抑制T細(xì)胞的功能，導(dǎo)致抗腫瘤免疫應(yīng)答受到嚴(yán)重影響[14,15]。我們發(fā)現(xiàn)，異位過表達(dá)IL-12能夠下調(diào)肝癌細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)(圖3B)，這與在黑色素瘤、乳腺癌模型中瘤內(nèi)注射IL-12載體觀察到的現(xiàn)象是一致的[9,10,13]。以上結(jié)果提示我們，IL-12基因治療能夠解除腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞對免疫細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答。值得注意的是，隨著PD-1、PD-L1阻斷療法的興起，PD-1/PD-L1聯(lián)合IL-12治療方案在針對乳腺癌臨床前試驗(yàn)中也取得了積極的治療效果[16-18]。

此外，腫瘤細(xì)胞還能通過降低淋巴細(xì)胞浸潤能力來逃逸免疫殺傷作用[15,19]。我們觀察到，肝癌細(xì)胞異位過表達(dá)IL-12能夠促進(jìn)脾淋巴細(xì)胞的募集作用。這可能與IL-12高表達(dá)調(diào)控肝癌細(xì)胞趨化因子譜有關(guān)。有報道稱乳腺癌模型中瘤內(nèi)注射IL-12能夠誘導(dǎo)CLL2、CCL3和CCL4的表達(dá)[20]，但是在肝癌模型中發(fā)揮關(guān)鍵作用的趨化因子尚待進(jìn)一步尋找。另外，肝癌細(xì)胞異位表達(dá)IL-12能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞中STAT1信號通路的活化，促進(jìn)IFN-γ和TNF-α等的表達(dá)，并且在動物實(shí)驗(yàn)中也觀察到類似的結(jié)果。以上結(jié)果表明，IL-12在腫瘤微環(huán)境中局部應(yīng)用能夠有效增加抗腫瘤免疫應(yīng)答。

以上研究提示，局部使用IL-12能夠更好地發(fā)揮抗腫瘤作用。一方面，IL-12以自分泌方式直接影響腫瘤特性；同時，IL-12在腫瘤局部有效表達(dá)，以旁分泌的形式活化微環(huán)境中免疫細(xì)胞，改善腫瘤免疫微環(huán)境。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為IL-12基因治療研究奠定了重要基礎(chǔ)。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展，IL-12基因治療或與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用將為臨床腫瘤治療提供新的途徑。