Astragaloside 對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的防治作用研究①

劉建春 張紅珍 郭文娟 柴 智 尉杰忠 于婧文 肖保國(guó) 馬存根

(山西中醫(yī)藥大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，國(guó)家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，晉中 030619)

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一種發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的自身免疫性疾病，炎癥反應(yīng)和隨后發(fā)生的神經(jīng)元凋亡為 MS 的兩大重要病理特征[1]。近年來，在全球范圍內(nèi) MS 的發(fā)病率逐年上升，但是對(duì)于 MS 的發(fā)病原因尚不明確，目前缺乏特效藥[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療 MS 主要集中于抗炎和免疫調(diào)節(jié)的方法，雖然可以在一定程度上緩解病情，但有些藥物副作用很大[3]。因此，尋找一種更安全有效的藥物，是當(dāng)前MS研究亟待解決的問題。

氣虛血瘀證是 MS 中醫(yī)辯證論治中常見證型之一，結(jié)合病癥 MS 的治療應(yīng)采用以補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)為主的益氣活血法[4]。黃芪為山西省的道地藥材之一，我國(guó)常用補(bǔ)氣中藥，黃酮類成分為其重要的化學(xué)組成之一，近年來藥理研究表明黃芪中黃酮類成分具有抗氧化、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等作用[5，6]。Astragaloside 是從黃芪中提取的黃酮類單體，本研究發(fā)揮地方資源優(yōu)勢(shì)，以 MS經(jīng)典的動(dòng)物模型——實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠為研究對(duì)象，探討黃芪中有效成分 Astragaloside 對(duì) EAE 的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為臨床有效防治多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病提供科學(xué)、可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 8～10周齡SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)前小鼠自由飲食喂養(yǎng)1周，飼養(yǎng)環(huán)境為25℃左右的無病原菌清潔級(jí)動(dòng)物房。

1.1.2藥物及試劑 Astragaloside (CAS No.17429-69-5)購(gòu)自愛必信(上海)生物科技有限公司(貨號(hào) abs 47006901)；小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白多肽35-55(Myelin oligodendrocyte glycoproten，MOG35-55)購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司(批號(hào)：9001)；百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)：231144)；結(jié)核分枝桿菌(Tuberculosis mycobacter ium，TB)購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司(批號(hào)：231141)；完全弗氏佐劑(Complete freund’s adjuvant，CFA)購(gòu)自美國(guó)Alexis公司。IL-1β、IL-10、IL-17、TNF-α酶聯(lián)免疫分析(ELISA)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海生物工程有限公司； Western blot抗體：β肌動(dòng)蛋白(β-actin)(批號(hào)：4870S)、p-MYPT1 購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司(批號(hào)：4563)；p-NF-κB/p65(批號(hào):ab86299)、ROCKⅡ(批號(hào)ab1250 25)購(gòu)自英國(guó)abcam 公司。

1.1.3儀器 凝膠電泳儀(Bio-Rad ，型號(hào)：PowerPacTM)；凝膠成像分析儀(Bio-Rad，型號(hào)：HOOD-Ⅱ)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo，型號(hào)：3131)；高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf，型號(hào)：5840)；酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，型號(hào)：DNM-9602)；洗板機(jī)(芬蘭Thermo Labsystems ，型號(hào)：AC8)。

1.2方法

1.2.1EAE小鼠模型制備 MOG35-55抗原乳劑的配制和注射均嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。

具體方法：MOG35-55濃度為250 μg/只，TB 濃度為350 μg/只，用生理鹽水配制MOG35-55，用完全弗氏佐劑配制TB，使用針管混合器將水劑和油劑1∶1充分混合，反復(fù)抽推,制成抗原乳劑，小鼠按 0.1 ml/只于脊柱兩側(cè)皮下4 個(gè)點(diǎn)分別注射抗原乳劑。將免疫當(dāng)天記為免疫后的第 0 天。在免疫當(dāng)日和免疫后的第2天，每只小鼠腹腔注射百日咳毒素(PTX)300 ng/只。小鼠出現(xiàn)尾部肌張力下降癥狀為EAE發(fā)病起始，即模型制備成功[8]。

1.2.2分組及給藥 C57BL/6 雌性小鼠按平均體質(zhì)量隨機(jī)分為 3 組：EAE對(duì)照組、Astragaloside 高劑量組和Astragaloside 低劑量組，每組6只。免疫后第3天開始給藥，給藥劑量為0.2 ml/(次·只)，EAE 對(duì)照組給予PBS；Astragaloside 高劑量組和Astragaloside 低劑量組分別給予黃芪甲苷溶液 30 mg/(kg·d)，15 mg/(kg·d)，持續(xù)給藥直至免疫后第27天。

1.2.3行為學(xué)檢測(cè) 在免疫后第0天開始每天定時(shí)觀察及評(píng)估小鼠癥狀、體征、體重變化和臨床評(píng)分，EAE臨床癥狀評(píng)分按照目前國(guó)際通用的5分法[8]：正常：0分；輕度步態(tài)笨拙，尾部張力消失：1分；步態(tài)蹣跚，單肢無力，被動(dòng)翻身后仍可以復(fù)位：2分；雙肢癱瘓，但給予刺激后可以挪動(dòng)：3分；四肢癱瘓：4分；瀕臨死亡或死亡：5分。癥狀介于兩個(gè)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)之間，以±0.5分計(jì)。

1.2.4標(biāo)本制備 在免疫后第28天，各組小鼠摘除一只眼球采血，制備血清；隨機(jī)取 EAE 組和Astragaloside 3只小鼠，采用10%水合氯醛(0.2 ml/只)腹腔注射麻醉，每組取3只推注PBS進(jìn)行心臟灌注，同時(shí)在冰上快速取小鼠脊髓和腦組織，冰上裂解，4℃離心提取蛋白，定量后采用 Western blot 技術(shù)檢測(cè)ROCKⅡ、P-MYPT1和p-NF-κB/p65的表達(dá)。各組其余3只小鼠推注PBS至肝臟發(fā)白，再推注 4%多聚甲醛進(jìn)行體內(nèi)組織固定。然后分離脊髓和腦，制作冷凍切片，冰切厚度10 μm，進(jìn)行HE染色。

1.2.5HE染色 在蒸餾水中浸潤(rùn)脊髓冰凍切片2 min，按照說明書，在切片上分別滴加蘇木精染液和伊紅染液進(jìn)行染色，梯度乙醇脫水，70%乙醇中1 min，70%乙醇中1 min，80%乙醇中1 min，90%乙醇中1 min，95%乙醇中1 min，100%乙醇中1 min，100%乙醇中 2 min；二甲苯透明5 min，用中性樹膠封片,鏡檢，拍照。

1.2.6ELISA法檢測(cè)外周血中細(xì)胞因子的表達(dá)量 采用ELISA試劑盒對(duì)細(xì)胞因子IL-1β、IL-17、TNF-α、IL-10濃度進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法嚴(yán)格參照說明書執(zhí)行。以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的多項(xiàng)式二次回歸方程，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

1.2.7Western blot法檢測(cè)脊髓組織中ROCKⅡ、P-MYPT1和p-NF-κB/p65 的表達(dá)變化 提取脊髓組織蛋白，用 BCA 法蛋白定量后，加入蛋白上樣緩沖液煮蛋白，用微量加樣器加入40 μg煮好的蛋白樣品。用10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。電泳完畢后，濕轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，5%脫脂奶粉封閉 2 h，按照說明書，加入一定比例的一抗 ROCK-Ⅱ、P-MYPT1、p-NF-κB/p65、β-actin，4℃ 過夜；次日洗滌后，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記偶聯(lián)二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃搖床室溫孵育2 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用凝膠成像儀檢測(cè)條帶，用BandScan分析灰度值與內(nèi)參的灰度值比值比較，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1小鼠發(fā)病時(shí)間、臨床評(píng)分和體重變化 Astragaloside 高、低劑量組均可延遲EAE發(fā)病，EAE對(duì)照組在免疫后第 8 天開始發(fā)病，Astragaloside 低劑量組、Astragaloside 高劑量組分別在免疫后第10天、12天開始發(fā)病。EAE對(duì)照組平均起病時(shí)間為(11.5±0.8)d，Astragaloside 高、低劑量組平均起病時(shí)間分別為(14.5±1.12)d，(12.5±1.12)d，與EAE對(duì)照組和Astragaloside 低劑量組比較，Astragaloside 高劑量組明顯延遲了EAE發(fā)病(圖1A，表1)。體重變化的結(jié)果顯示，EAE 對(duì)照組隨著臨床癥狀的加重，體重明顯減輕，Astragaloside 高、低劑量組在改善臨床癥狀的同時(shí)，體重減輕較少(圖1B)。臨床癥狀曲線清晰地顯示，與 EAE對(duì)照組比較，Astragaloside 高劑量組在免疫后13～27 d，Astragaloside 低劑量組在免疫后13～18 d，臨床評(píng)分顯著降低(P<0.01，P<0.001)(圖1A)；EAE對(duì)照組平均最高臨床評(píng)分為(2.6±0.97)分；Astragaloside 高、低劑量組平均最高臨床評(píng)分分別為(0.75±0.56)分，(1.08±0.61)分；與EAE對(duì)照組比較，Astragaloside 高、低劑量組均可明顯降低平均最高臨床評(píng)分，減輕EAE臨床癥狀(P<0.01，P<0.05)(圖2B，表1)。

上述結(jié)果表明，Astragaloside高、低劑量組均能延遲EAE發(fā)病，縮短病程，減緩EAE臨床癥狀，As-tragaloside 30 mg/(kg·d)為治療EAE的有效劑量。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以高劑量為給藥劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 小鼠臨床評(píng)分和體重的變化Fig.1 Changes in clinical scores and body weight of miceNote:Compared with EAE control group,**.P<0.01,***.P<0.001.

表1 小鼠平均起病時(shí)間、平均最高臨床評(píng)分的變化

圖2 小鼠平均起病時(shí)間和平均最高臨床評(píng)分的變化Fig.2 Changes in mean onset time and highest mean clinical score of miceNote:Compared with EAE control group,*.P<0.05，**.P<0.01.

2.2Astragaloside對(duì)脊髓炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響 HE染色顯示，EAE對(duì)照組小鼠脊髓白質(zhì)區(qū)炎癥細(xì)胞成大片點(diǎn)狀分布，血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)呈袖套樣改變，而 Astragaloside 組幾乎無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，Astragaloside 可抑制脊髓炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。

圖3 小鼠脊髓組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的情況(HE染色)Fig.3 Inflammatory cell infiltration in mouse spinal cord (HE staining)

2.3Astragaloside對(duì)血清中細(xì)胞因子的影響 與EAE對(duì)照組比較，Astragaloside可顯著降低血清中IL-1β、IL-17的表達(dá)(P<0.05，P<0.001)，增加血清IL-10水平(P<0.05)，對(duì)血清TNF-α水平有下調(diào)趨勢(shì) (圖4)。

圖4 小鼠血清中細(xì)胞因子的變化Fig.4 Changes of cytokines in serum of miceNote:Compared with EAE control group,*.P<0.05，***.P<0.001.

2.4EAE小鼠脊髓組織ROCKⅡ、P-MYPT1、p-NF-κB/p65 的表達(dá)變化 與EAE對(duì)照組比較，Astragaloside組ROCKⅡ、P-MYPT1、p-NF-κB/p65在脊髓的表達(dá)明顯得到抑制(P<0.05)(圖5)。

圖5 小鼠脊髓組織ROCKⅡ、P-MYPT1、p-NF-κB/p65 的表達(dá)變化Fig.5 Expression of ROCKⅡ，P-MYPT1 and p-NF-κB/p65 in Spinal cord of miceNote:Compared with EAE control group,*.P<0.05.

3 討論

MS是一種發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫介導(dǎo)性疾病，炎性脫髓鞘與神經(jīng)退行性變是其主要的病理特征[9]。其病因和發(fā)病機(jī)理目前尚不完全清楚[10-12]。治療方面，迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)可以治愈MS的理想藥物[13]。

中醫(yī)藥以多靶點(diǎn)、多途徑、整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)在延緩MS進(jìn)程方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。氣虛血瘀證是 MS 的一個(gè)重要證候要素之一[14]。黃芪為我國(guó)常用益氣中藥，近年來研究表明，黃芪中黃酮類成分具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等功效[3，15]。Astragal-oside 是從黃芪中分離得到的一種單體黃酮苷，本研究在免疫后第 3 天給予 Astragaloside 干預(yù)治療，結(jié)果顯示，Astragaloside 高、低劑量組均可明顯降低臨床評(píng)分，減輕EAE臨床癥狀，Astragaloside以30 mg/(kg·d)為有效劑量。外周免疫的炎癥細(xì)胞向中樞遷移的多少與 EAE 疾病發(fā)病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，我們采用HE染色分析了脊髓組織的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況，病理結(jié)果證實(shí)，Astragaloside可抑制脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

MS/EAE 最主要的發(fā)病機(jī)制是免疫失衡[16，17]，其病理過程涉及多種免疫活性細(xì)胞，CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)起主要作用。初始CD4+T 細(xì)胞在抗原的刺激下，在不同的條件下可分化成不同亞型的效應(yīng)T細(xì)胞，包括Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)等[18]，執(zhí)行不同的功能。Th1細(xì)胞活化后分泌TNF-α、IL-1β、IFN-γ 等促炎細(xì)胞因子；Th2 細(xì)胞則主要分泌IL-4、IL-10 等抑炎細(xì)胞因子，可以抑制免疫反應(yīng)；Th17細(xì)胞能夠分泌促炎癥因子IL-17，Meta 分析結(jié)果顯示，血清IL-17水平與脫髓鞘神經(jīng)疾病 MS 具有明顯的相關(guān)性，MS 患者血清IL-17 水平明顯高于健康人群[19]。本實(shí)驗(yàn)的ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，Astragaloside可通過顯著降低血清中IL-1β、IL-17的表達(dá)，增加血清IL-10水平，從而抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

Rho激酶(ROCK)信號(hào)通路是生物體中廣泛存在的經(jīng)典信號(hào)通路，參與多種生理調(diào)節(jié)過程。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Rho/ROCKⅡ信號(hào)主要涉及神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生、軸突和樹突的生長(zhǎng)與數(shù)量、樹突重塑、軸突導(dǎo)向、突觸的結(jié)構(gòu)與功能，以及神經(jīng)細(xì)胞的損傷、修復(fù)與凋亡[20，21]。ROCK信號(hào)通路的激活與 MS/EAE 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。磷酸化的肌球蛋白磷脂酶-靶向亞基1(p-MYPT1)是ROCK作用的底物，p-MYPT1水平的高低直接顯示ROCK在體內(nèi)的活性水平[22]。我們通過Western blot方法對(duì)脊髓ROCKⅡ、p-MYPT1以及p-NF-κB/p65進(jìn)行了檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Astragaloside能明顯降低MYPT1 的磷酸化程度，抑制p-NF-κB/p65的表達(dá)，對(duì)ROCK活化起到抑制作用。

綜上所述，Astragaloside 治療EAE可明顯改善EAE臨床癥狀、抑制炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可能與其調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌，抑制ROCK通路的激活有關(guān)，為進(jìn)一步研究MS等自身免疫性疾病打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，也為山西道地藥材黃芪的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。