miR-137對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)及自噬的作用及機(jī)制研究①

丁 童 贠 霄 周彥鵬 楊衛(wèi)強(qiáng) 馮立平

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院創(chuàng)傷外科，新鄉(xiāng) 453000)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種關(guān)節(jié)軟骨和骨連接處損傷的關(guān)節(jié)疾病,最主要的癥狀為關(guān)節(jié)疼痛和僵硬，并伴有關(guān)節(jié)腫痛，活動(dòng)受限，四肢麻木等[1]。骨關(guān)節(jié)炎為最常見的關(guān)節(jié)疾病，影響著大約2.37億人(約占總?cè)丝诘?.3%)[2]。在超過60歲的老年人口中，大約有10%的男性和18%的女性受到關(guān)節(jié)炎的折磨[1]。既往研究報(bào)道，miR-137在多種腫瘤中表達(dá)下降，并且可以作為腫瘤預(yù)后的診斷分子，如肺癌、結(jié)腸癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等[3,4]。另一方面，miR-137還可以通過靶向MK2基因來抑制炎癥應(yīng)答和細(xì)胞凋亡來保護(hù)脊柱神經(jīng)損傷[5]。另外還有研究證明，在人類及小鼠的生長發(fā)育過程中，miR-137具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用[6]，同時(shí)IL-1β還在OA的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，如IL-1β可以促進(jìn)滑膜細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞釋放中性蛋白酶和前列腺素E2，這些因子通過刺激關(guān)節(jié)細(xì)胞發(fā)生關(guān)節(jié)炎癥，而導(dǎo)致關(guān)節(jié)發(fā)生退行性關(guān)節(jié)炎[7]。但是針對(duì)OA發(fā)生發(fā)展涉及miR-137和IL-1β相關(guān)的信號(hào)機(jī)制研究結(jié)果鮮有報(bào)道，因此我們根據(jù)既往的研究結(jié)果，利用IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)為研究體系，對(duì)軟骨細(xì)胞中可能對(duì)細(xì)胞命運(yùn)產(chǎn)生影響的miR-137機(jī)制進(jìn)行深入探究，期望為軟骨細(xì)胞炎癥的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清和胰酶均購自美國Gibco公司。轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofecta-mine3000(貨號(hào)：L3000008)購自Thermo公司。IL-1β(貨號(hào)：ab119727)、BMP2(貨號(hào)：ab14933)、CollagenⅠ(貨號(hào)：ab34710)、Beclin-1(貨號(hào)：ab207612)、P62(貨號(hào)：ab56416)、LC3A/B(貨號(hào)：ab128025)、β-actin(貨號(hào)：ab124964)一抗購自美國abcam公司。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。SYBR PCR Master Mix(貨號(hào)：4309155)購自賽默飛公司。IL-6(貨號(hào)：E-EL-M0044c)、iNOS(貨號(hào)：E-EL-R0520c)、TNF-α(貨號(hào)：E-EL-R0019c) BGP(貨號(hào)：E-EL-R0243c)、ALP(貨號(hào)：E-BC-K091)ELISA試劑盒購自Elabscience公司。3月齡SD雌性大鼠，體重(260±20)g，購自北京維通利華。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵從于《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2方法

1.2.1大鼠原代軟骨細(xì)胞分離 將3月齡SD雌性大鼠，膝關(guān)節(jié)軟骨于無菌環(huán)境下取出，放進(jìn)無菌操作臺(tái)，使用PBS沖洗3次，剔除非軟骨組織。用PBS再次清洗后放入離心管中，加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培養(yǎng)箱30 min后取出終止消化，去除成纖維細(xì)胞；將樣品轉(zhuǎn)入加有PBS的培養(yǎng)皿中，使用無菌剪將軟骨剪成1 mm3的碎塊，經(jīng)PBS洗滌3次后加入膠原酶Ⅱ在37℃搖床中消化至懸液渾濁。樣品再經(jīng)100 μm細(xì)胞篩過濾，收集濾液，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清，PBS清洗3次，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，按照1×107個(gè)/皿接種至10 cm 培養(yǎng)皿中，37℃正常培養(yǎng)。

1.2.2軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染 軟骨細(xì)胞鋪板24 h后換液，使用Lipofectamine 3000(μl)∶待轉(zhuǎn)DNA(μg)=4∶1。按照分組進(jìn)行相應(yīng)轉(zhuǎn)染處理(細(xì)胞隨機(jī)分為5組,即Ctrl組，scramble組，IL-1β組，mimic組和mimic+IL-1β組。其中空白對(duì)照組正常細(xì)胞培養(yǎng);scramble組細(xì)胞轉(zhuǎn)染scrambleRNA； IL-1β組細(xì)胞用10 μmol/L IL-1β處理；mimic組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-137mimic；mimic+IL-1β組細(xì)胞轉(zhuǎn)染和miR-137mimic 并接受IL-1β處理)。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞待用。顯微鏡下(隨機(jī)挑選5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì))得瞬時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率約為70%。

1.2.3qRT-PCR檢測軟骨細(xì)胞中相關(guān)RNA水平 取轉(zhuǎn)染后的軟骨細(xì)胞，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度、純度后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，用SYBR PCR Master Mix試劑盒對(duì)miR-137表達(dá)水平進(jìn)行檢測，以GAPDH為內(nèi)參。實(shí)驗(yàn)所用引物均采用Primer 3 Plus網(wǎng)站設(shè)計(jì)，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，重復(fù)3次。

1.2.4Western blot檢測細(xì)胞中蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，PBS清洗3次，用添加有終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，提取各組細(xì)胞總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度(具體檢測按照試劑說明書進(jìn)行)，10%SDS-PAGE膠分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入一抗于4℃封閉過夜，第二天加入對(duì)應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴加ECL曝光顯影。顯色并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5ELISA檢測炎癥因子 胰酶消化細(xì)胞收集后，低溫離心機(jī)800 r/min離心8 min，將收集細(xì)胞進(jìn)行冷PBS洗滌3次；將細(xì)胞處于-20℃與室溫之間進(jìn)行反復(fù)凍融3次后于1 500 g離心10 min收集上清液供實(shí)驗(yàn)使用。加樣設(shè)置：分別設(shè)空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔，待測樣品孔。酶標(biāo)包被的板子上加標(biāo)準(zhǔn)品50 μl，先加入樣品稀釋液40 μl于待測樣品孔，然后加待測樣品10 μl。孵育：封板后置于37℃環(huán)境進(jìn)行30 min孵育。液體配置：把30×洗滌母液經(jīng)蒸餾水稀釋30倍備用。洗滌：緩慢揭掉封板膜，將液體棄去，甩干液體，每孔加洗滌液，放置30 s之后棄去，重復(fù)5次，拍干板子。加酶：每孔加酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔不加。孵育：再次封板后放37℃孵育30 min。洗滌：小心取掉封板膜，甩去液體，甩干液體，每孔加適量洗滌液，放置30 s之后棄去，重復(fù)5次，拍干板子。顯色：各孔加入顯色劑A液50 μl，再加顯色劑B液50 μl緩慢振蕩混勻后，37℃避光進(jìn)行顯色10 min。終止：各孔加入50 μl終止反應(yīng)液，反應(yīng)終止(終止后藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色)。測定：用空白孔進(jìn)行調(diào)零，450 nm波長下依次測量每孔吸光值(OD值)。測定應(yīng)在加入終止液后的15 min內(nèi)進(jìn)行。

1.2.6免疫熒光 操作步驟按照說明書進(jìn)行，細(xì)胞接種于預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被的蓋玻片，經(jīng)藥物處理后，加入4%多聚甲醛固定30 min。PBS漂洗，用含Triton X-100封閉液在冰上通透5 min；吸掉通透液，加入預(yù)溫的封閉液，室溫下封閉1 h；孵育一抗4℃過夜。次日，PBS漂洗，孵育熒光標(biāo)記的二抗(濃度為1∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS漂洗，50%甘油-指甲油封片，立即避光共聚焦顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1miR-137在不同處理組中差異表達(dá) 經(jīng)過細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及添加IL-1β后miR-137表達(dá)水平：與空白Ctrl組比較，陰性對(duì)照scramble組miR-137表達(dá)水平無顯著差異(因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)不再添加Ctrl組比較)；與scramble組比較，單獨(dú)添加IL-1β組miR-137表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01，圖1)；而miR-137 mimic組中miR-137表達(dá)水平則明顯上升。

圖1 miR-137在不同處理組中表達(dá)差異Fig.1 Expression of miR-137 was detected in chondro-cytes among different groupsNote:The expression of miR-137 was detected by qRT-PCR.Data shown are the means of each group.**.P<0.01 compared with the scramble group.Bars,SEs.

2.2miR-137對(duì)BGP和ALP表達(dá)的影響 細(xì)胞經(jīng)過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染各組外源核酸及IL-1β后，經(jīng)過ELISA檢測BGP和ALP表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：miR-137 mimic組與scramble組之間BGP和ALP表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異；但是經(jīng)過IL-1β處理后，BGP和ALP表達(dá)受到顯著的下調(diào)(P<0.01，圖2)；與IL-1β組比較，mimic+IL-1β組BGP和ALP表達(dá)水平得到一定的補(bǔ)償，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖2 ELISA檢測軟骨細(xì)胞中BGP和ALP表水平Fig.2 Expression of BGP and ALP were detected by ELISANote:Data are expressed as compared with the mimic group;##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.3miR-137 促進(jìn)軟骨細(xì)胞中軟骨功能相關(guān)蛋白表達(dá) 經(jīng)過Western blot檢測各組處理后的組織細(xì)胞發(fā)現(xiàn)：mimic組軟骨細(xì)胞中BMP2和CollagenⅠ表達(dá)量與scramble組之間無顯著差異；但是經(jīng)過IL-1β處理后，BMP2和CollagenⅠ表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01，圖3)；而mimic+IL-1β組軟骨細(xì)胞中BMP2和CollagenⅠ表達(dá)量則有所恢復(fù)，相對(duì)于IL-1β組差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖3 Western blot檢測各處理組軟骨細(xì)胞中BMP2和CollagenⅠ表達(dá)水平Fig.3 BMP2 and CollagenⅠ were detected by Western blot in each group of chondrocytesNote:BMP2 and CollagenⅠ were detected using Western blot analysis.Data are expressed as compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.4miR-137抑制軟骨組織細(xì)胞中炎癥因子表達(dá) 各組細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后利用ELISA檢測相關(guān)炎癥因子發(fā)現(xiàn)：與scramble組相比，mimic組軟骨細(xì)胞內(nèi)炎癥因子IL-6、iNOS和TNF-α水平無顯著差異；與mimic組相比，IL-1β處理后的軟骨細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平發(fā)生明顯的上調(diào)(P<0.01，圖4)；mimic+IL-1β組軟骨細(xì)胞中相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平受到顯著抑制(P<0.01，圖4)。

圖4 ELISA檢測各處理組中軟骨細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平Fig.4 Expression of inflammatory factors were detected in each group of chondrocytesNote:IL-6,iNOS and TNF-α were detected using ELISA.Data are expressed as compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

2.5miR-137抑制軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá) Western blot檢測各組軟骨細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白質(zhì)分子發(fā)現(xiàn)：與scramble組細(xì)胞相比，mimic組細(xì)胞中自噬相關(guān)的Beclin-1、P62和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異；與mimic組細(xì)胞表達(dá)水平相比，IL-1β組細(xì)胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平發(fā)生顯著上調(diào)，而P62表達(dá)水平發(fā)生明顯下調(diào)(P<0.01，圖5)；與IL-1β組相比，mimic+IL-1β組中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá)水平受到了明顯的下調(diào)，而P62的表達(dá)水平則顯著上調(diào)(P<0.01，圖5)。免疫熒光染色鑒定細(xì)胞內(nèi)LC3+細(xì)胞顯示：與scramble組比較，mimic組LC3+細(xì)胞含量和數(shù)量之間沒有顯著性差異；與mimic組相比，IL-1β組LC3+細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)大量的綠色熒光，并且?guī)缀跛械募?xì)胞中都有分布；與IL-1β組相比，mimic+IL-1β組中LC3陽性的數(shù)量相對(duì)減少，熒光亮度減弱，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)。

圖5 Western blot和免疫熒光技術(shù)檢測各處理細(xì)胞自噬相關(guān)分子表達(dá)和分布情況Fig.5 Expression and distribution of autophagy-related proteins were detected by Western blot and immunofluorence in each group of chondrocytesNote:The autophagy markers were detected by Western blot.The LC3+were detected by the immunofluorence.Data are expressed as the compared with the mimic group；##.P<0.01 compared with the IL-1β group.Bars,SEs.

3 討論

OA是被公認(rèn)的最常見的致殘影響因素之一，會(huì)伴隨著長期慢性疼痛并降低運(yùn)動(dòng)耐受能力[8,9]。OA形成的諸多風(fēng)險(xiǎn)因素主要包括：體重，年齡，女性，關(guān)節(jié)受損、過度使用，肌肉和韌帶無力等[10]。關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)唯一具有功能的軟骨細(xì)胞數(shù)目及穩(wěn)定的功能對(duì)維持軟骨基質(zhì)合成、軟骨穩(wěn)態(tài)和降解平衡有著至關(guān)重要的作用。OA發(fā)生的同時(shí)，炎癥因子、異常力學(xué)刺激等都會(huì)使軟骨局部微環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能異常、肥大、數(shù)目減少，軟骨基質(zhì)合成能力減弱，聚蛋白多糖分泌減少，基質(zhì)降解酶(金屬基質(zhì)降解酶：Matrix Metalloproteinases，MMPs)等表達(dá)增加，促使軟骨基質(zhì)降解[11]。

miR-137雖然在多種腫瘤中表達(dá)下降，可以作為腫瘤治療預(yù)后的診斷分子[3,4]，同時(shí)miR-137還可以通過靶向MK2基因來抑制炎癥應(yīng)答和細(xì)胞凋亡來保護(hù)脊柱神經(jīng)損傷[5]。說明miR-137具有一定的炎癥抑制作用。有研究報(bào)道，IRF1和NF-κB依賴的iNOS激活可以產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，從而產(chǎn)生大量的炎癥因子，如促炎因子IL-1、TNF-α和干擾素γ等[12]。一般機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的iNOS通常是在氧化環(huán)境中，高表達(dá)水平的NO通常會(huì)與超氧化物發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致過氧化亞硝基產(chǎn)物產(chǎn)生細(xì)胞毒性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過IL-1β處理后的軟骨細(xì)胞表達(dá)大量炎癥因子IL-6、iNOS和TNF-α；但是經(jīng)過miR-137 mimic處理后得到了明顯改善，證明miR-137可以有效抑制軟骨細(xì)胞炎癥的分泌。

細(xì)胞自噬對(duì)于軟骨細(xì)胞具有兩面性作用：既可以作為細(xì)胞中細(xì)胞器組建的原材料供應(yīng)者，也就是細(xì)胞結(jié)構(gòu)經(jīng)過自噬后再循環(huán)利用，來保證細(xì)胞常態(tài)下代謝活動(dòng)的高效利用；又可以因?yàn)橥獠凯h(huán)境不適，造成細(xì)胞自噬依賴的程序性死亡異常啟動(dòng)，造成這一現(xiàn)象差異的原因可能是因?yàn)榧膊〔煌M(jìn)展階段造成的影響，或是生理病理狀態(tài)導(dǎo)致的差異而形成不同的自噬作用[14]。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，miR-137可以通過靶向ATG7的表達(dá)來抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬現(xiàn)象[15]。我們研究發(fā)現(xiàn)在scramble組正常表達(dá)的基礎(chǔ)上，IL-1β組軟骨細(xì)胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ發(fā)生明顯的上調(diào)，P62發(fā)生下調(diào)；說明軟骨細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了自噬作用來響應(yīng)IL-1β的刺激，并有進(jìn)一步發(fā)生自噬性凋亡的趨勢；但是在miR-137+IL-1β組中，自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平又有一定的下調(diào)趨勢，說明miR-137可以有效抑制軟骨細(xì)胞中自噬進(jìn)展，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的影響。

當(dāng)然，軟骨細(xì)胞炎癥的發(fā)生發(fā)展具有十分復(fù)雜的特點(diǎn)，而且據(jù)報(bào)道自噬在其中發(fā)揮調(diào)節(jié)的方式也不盡相同[14]。根據(jù)研究結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞炎癥發(fā)生了強(qiáng)烈的自噬現(xiàn)象，說明細(xì)胞命運(yùn)更加趨向于自噬依賴性的程序性死亡。細(xì)胞代償性增加自噬作用有利于細(xì)胞生存，但是若持續(xù)性增加自噬作用細(xì)胞便會(huì)受到損害而發(fā)生凋亡[14-20]。因此針對(duì)該項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方案還需要進(jìn)一步探究相關(guān)凋亡通路活性來驗(yàn)證自噬和凋亡之間的相互作用關(guān)系；并進(jìn)一步深入探究IL-1β在該軟骨細(xì)胞炎癥誘導(dǎo)模型中的信號(hào)機(jī)制。

綜上，miR-137可以在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)體系中有效降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞自噬水平，并可以刺激細(xì)胞分泌大量的BMP2和CollagenⅠ，來發(fā)揮軟骨細(xì)胞生理活性功能。miR-137這種對(duì)軟骨細(xì)胞炎癥的保護(hù)效果為骨關(guān)節(jié)炎癥的治療提供了一種全新的參考形式。但是涉及microRNAs的調(diào)控通路眾多而復(fù)雜，明確具體信號(hào)調(diào)控機(jī)制才能為臨床精準(zhǔn)化治療骨關(guān)節(jié)炎提供指導(dǎo)依據(jù)。