量子降脂儀對(duì)自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和抗氧化能力的影響

孫德春 王超 高磊 孫健 李志才 李曉文 李盛鈺

1.中國(guó)科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇蘇州 215163；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長(zhǎng)春 130033；3.長(zhǎng)春先盈醫(yī)療科技有限公司，吉林長(zhǎng)春 130103

衰老是機(jī)體各器官、組織隨著年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生退行性變化的過(guò)程[1]。現(xiàn)代研究認(rèn)為：衰老也是一種疾病，是可以被治療和預(yù)防的。目前已有很多抗衰老或延緩衰老的藥物或新成分得以開(kāi)發(fā)研究[2-6]?？顾ダ厢t(yī)療器械也在研發(fā)中。

量子降脂儀釋放的量子能量被人體選擇性吸收，發(fā)生生物刺激作用，能利用人體血脂代謝的固有途徑，矯正血脂代謝紊亂，起到治療血脂異常的作用，且不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷[7]。由于人體衰老存在不同程度的代謝紊亂、血脂、血黏度增高、脂褐素沉積等病理生理變化[8-9]，那么量子降脂儀在有效矯正人體血脂代謝紊亂的同時(shí)是否對(duì)人體具有一定的抗衰老和延緩衰老作用，值得深入研究。本研究以自然衰老小鼠為研究對(duì)象，給予相同量子強(qiáng)度不同治療時(shí)間，觀(guān)察量子降脂儀對(duì)模型動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力及抗氧化能力的影響，為量子降脂儀抗衰老作用積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只SPF級(jí)昆明種雌性小鼠，6周齡，體重18～22 g；80只SPF級(jí)昆明種雌性小鼠，11月齡，體重40～50 g，均購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)-2011-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

量子降脂儀（吉食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第2260103號(hào)），長(zhǎng)春先盈醫(yī)療科技有限公司；跳臺(tái)儀（ZH-800S），安徽正華生物儀器有限公司；Morris水迷宮（Morris），安徽正華生物儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理方法 20只SPF級(jí)昆明種雌性小鼠，6周齡，用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，作為對(duì)照組，從試驗(yàn)第1周開(kāi)始至第5周結(jié)束采用普通飼料飼喂，自由攝食，自由飲用蒸餾水。

80只SPF級(jí)昆明種雌性小鼠，11月齡，用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組，即模型組、陽(yáng)性組、低強(qiáng)度組、高強(qiáng)度組，每組20只，從試驗(yàn)第1周開(kāi)始至第5周結(jié)束均采用普通飼料飼喂，自由攝食，自由飲用蒸餾水。陽(yáng)性治療組于第1周至第2周每天灌胃一次維生素E 40 mg/kg，第3周休養(yǎng)一周，第4周至第5周繼續(xù)每天灌胃一次維生素E 40 mg/kg。高強(qiáng)度治療組和低強(qiáng)度治療組采用量子降脂儀進(jìn)行治療，強(qiáng)度功率輸出為65 uw/cm2。低強(qiáng)度治療組于第1周至第2周每天治療1次，每次治療5 min；第3周休養(yǎng)一周；第4周至第5周繼續(xù)每天治療1次，每次治療5 min。高強(qiáng)度治療組于第1周至第2周每天治療2次，每次治療10 min；第3周休養(yǎng)一周；第4周至第5周繼續(xù)每天治療2次，每次治療10 min。

1.3.2 跳臺(tái)試驗(yàn) 末次治療后，各組小鼠進(jìn)行跳臺(tái)試驗(yàn)。將小鼠置于反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)5 min，立即通以36V交流電，記錄小鼠第1次跳下平臺(tái)的時(shí)間（即潛伏期）及在5 min內(nèi)被電擊次數(shù)（即錯(cuò)誤次數(shù)），以此作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后將小鼠直接置于跳臺(tái)上，重復(fù)測(cè)驗(yàn)，記錄小鼠第1次跳下平臺(tái)的時(shí)間及在5 min內(nèi)被電擊次數(shù)，以此作為記憶成績(jī)。

1.3.3 Morris水迷宮試驗(yàn) 末次治療后，各組小鼠進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，連續(xù)進(jìn)行6天，前5天為定位航行實(shí)驗(yàn)，第6天為空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：每天進(jìn)行4次訓(xùn)練，每次將小鼠面向池壁分別從不同的入水點(diǎn)放入水中，記錄小鼠從入水到找到水下隱藏平臺(tái)所需的時(shí)間（即逃避潛伏期）、平均游泳速度，90s內(nèi)停留在目的象限里的活動(dòng)時(shí)間、游泳距離及游泳總路程?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：撤去水中平臺(tái)，以水池中任一象限的一個(gè)位置作為入水點(diǎn)，讓小鼠在池內(nèi)游泳找尋平臺(tái)，記錄小鼠第一次通過(guò)平臺(tái)所需時(shí)間、通過(guò)平臺(tái)次數(shù)、平均游泳速度、90s內(nèi)停留在目的象限的時(shí)間和游泳距離以及游泳總路程。路程百分比及時(shí)間百分比計(jì)算公式如下：路程百分比=目標(biāo)象限游泳路程/總路程；時(shí)間百分比=目標(biāo)象限內(nèi)游泳時(shí)間/總時(shí)間。

1.3.4 血清及組織樣品的制備 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，稱(chēng)體質(zhì)量后摘取眼球取血，于4℃、3 000 r/min離心10 min，收集血清，置于-80℃冰箱備用。將取血后的小鼠頸椎脫臼處死，冰袋上迅速解剖取出小鼠肝臟、腎臟、脾臟、卵巢及腦組織，棉簽吸去浮血并稱(chēng)其質(zhì)量，隨后將小鼠肝臟置于冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干，用預(yù)冷生理鹽水制備1%和10%組織勻漿，于4℃、4 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 臟器指數(shù)的測(cè)定 根據(jù)1.3.4方法中已記錄的小鼠稱(chēng)體質(zhì)量及解剖后小鼠后各臟器質(zhì)量，按照以下公式計(jì)算小鼠臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(mg/g)=臟器濕重(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)

1.3.6 血清及臟器組織中檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法抗氧化指標(biāo)：分別檢測(cè)小鼠血清、肝臟組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）等的含量，及血清中端粒酶的含量。

性激素指標(biāo)：分別檢測(cè)小鼠血清中卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生長(zhǎng)激素（luteinizing hormone，LH）的含量。

以上指標(biāo)的測(cè)定均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，各檢測(cè)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力指標(biāo)比較

表1 各組小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)記憶成績(jī)（±s）

表1 各組小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)記憶成績(jī)（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

由表1可以看出，與模型組相比，陽(yáng)性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組均能延長(zhǎng)小鼠第1次跳下平臺(tái)的時(shí)間，降低小鼠5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)，且陽(yáng)性組、高強(qiáng)度組小鼠的潛伏期組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明高強(qiáng)度量子降脂儀治療能提高自然衰老小鼠非空間性長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶的能力。

由表2可見(jiàn)，在定位航行試驗(yàn)中，與模型組相比，陽(yáng)性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），陽(yáng)性組、高強(qiáng)度組小鼠的游泳平均速度提升，陽(yáng)性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的路程百分比和時(shí)間百分比明顯增加，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組小鼠定位航行試驗(yàn)比較（±s）

表2 各組小鼠定位航行試驗(yàn)比較（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

表3 各組小鼠空間搜索試驗(yàn)比較（±s）

表3 各組小鼠空間搜索試驗(yàn)比較（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

由表3可見(jiàn)，在空間搜索試驗(yàn)中，與模型組相比，低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的路程百分比和時(shí)間百分比均有提升，且高強(qiáng)度組小鼠的路程百分比和時(shí)間百分明顯高于模型組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。可見(jiàn)量子降脂儀對(duì)自然衰老小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力有所提高。

2.2 各組小鼠臟器指數(shù)及抗氧化指標(biāo)比較

表4 各組小鼠臟器指數(shù)比較（±s，mg/g）

表4 各組小鼠臟器指數(shù)比較（±s，mg/g）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

由表4可知，與模型組相比，陽(yáng)性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的臟器指數(shù)雖均有增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由表5和表6可知，與模型組相比，陽(yáng)性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組小鼠的血清和肝臟中的SOD、GSH-Px和CAT含量均有升高，MDA含量下降，高強(qiáng)度組和陽(yáng)性組與模型組的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表5 各組小鼠血清抗氧化指標(biāo)比較（±s）

表5 各組小鼠血清抗氧化指標(biāo)比較（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

表6 各組小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)比較（±s）

表6 各組小鼠肝臟抗氧化指標(biāo)比較（±s）

與模型組相比，* P＜0.05，** P＜0.01。

2.3 各組小鼠血清中端粒酶含量及雌性激素比較

圖1 量子降脂儀對(duì)自然衰老小鼠血清中端粒酶濃度的影響

由圖1可知，與模型組相比，陽(yáng)性組、低強(qiáng)度組和高強(qiáng)度組自然衰老小鼠血清中端粒酶濃度的含量有不同程度的升高，與模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高強(qiáng)度組血清中端粒酶濃度的含量高于低強(qiáng)度組，接近陽(yáng)性組，說(shuō)明量子降脂儀能夠提高自然衰老小鼠端粒酶的含量，延長(zhǎng)自然衰老小鼠的細(xì)胞壽命。

表7 各組小鼠血清中雌性激素指標(biāo)比較

由表7可知，各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，卵泡刺激素（FSH）和黃體生長(zhǎng)激素（LH）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用自然衰老小鼠建立模型，以求最大程度接近衰老機(jī)體內(nèi)環(huán)境。腦部衰老的顯著表現(xiàn)就是學(xué)習(xí)能力的下降和記憶出現(xiàn)障礙，大量研究已經(jīng)證實(shí)人和動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力存在增齡性衰退現(xiàn)象[10-12]，尤其是空間參考記憶能力隨年齡增長(zhǎng)呈減退趨勢(shì)[13]。所以采用跳臺(tái)試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)小鼠長(zhǎng)期學(xué)習(xí)記憶的能力。跳臺(tái)試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠潛伏期明顯縮短，經(jīng)過(guò)量子降脂儀治療后潛伏期明顯延長(zhǎng)且5 min內(nèi)出現(xiàn)的錯(cuò)誤次數(shù)降低；Morris水迷宮小鼠在游泳訓(xùn)練中對(duì)于尋找安全平臺(tái)產(chǎn)生一定的學(xué)習(xí)和記憶能力，試驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠經(jīng)量子降脂儀治療后逃避潛伏期明顯縮短，說(shuō)明量子降脂儀對(duì)學(xué)習(xí)和記憶能力嚴(yán)重受損的自然衰老的小鼠有一定的治療作用。

氧化損傷是細(xì)胞衰老的主流學(xué)說(shuō)，自由基極易對(duì)細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸進(jìn)行侵害，形成脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[14]。SOD是機(jī)體內(nèi)清除自由基的重要物質(zhì)，在抗衰老研究中檢測(cè)SOD活性可作為判斷衰老程度的重要指標(biāo)[15-16]，其活性大小可以反映機(jī)體清除自由基能力[17]；GSH-Px可以催化還原性GSH與H2O2反應(yīng)生成對(duì)機(jī)體無(wú)害的水和氧化型GSH，有利于保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及功能的完整性[18]；CAT在生物機(jī)體內(nèi)普遍存，保護(hù)機(jī)體免受有害物質(zhì)損傷[19]；MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，可間接反映機(jī)體的氧化損傷程度[20]。本研究表明，高強(qiáng)度治療組的小鼠SOD、GSH-Px和CAT等抗氧化酶活性明顯提高，MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物減少，提示量子降脂儀能夠提高自然衰老小鼠清除自由基的能力，減少過(guò)氧化產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的損傷，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而降低機(jī)體的老化程度，發(fā)揮其抗衰老作用。

端粒是存在于真核細(xì)胞染色體的末端特殊的一個(gè)結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度隨著細(xì)胞的不斷分裂而不斷縮短，當(dāng)其縮短到一定程度后，細(xì)胞則停止分裂即趨向衰老和死亡，所以端粒的長(zhǎng)度決定了細(xì)胞的壽命[21]。而端粒酶則是一種核蛋白的逆轉(zhuǎn)錄酶，它的活性表達(dá)可以穩(wěn)定端粒長(zhǎng)度防止其在復(fù)制中不斷縮短[22-23]，細(xì)胞壽命也就得以延長(zhǎng)。本研究表明，量子降脂儀能夠提高自然衰老小鼠血清中端粒酶活性，延緩端?？s短可能是其抗衰老作用的機(jī)制之一，但由于端粒酶的激活受多因素影響[24-25]，故量子降脂儀對(duì)其活性的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

機(jī)體的衰老程度也會(huì)反映在腦、胸腺、脾、肝、腎等臟器指數(shù)的變化上[26]。但本研究結(jié)果提示，量子降脂儀能夠增加自然衰老小鼠的臟器指數(shù)，但卻無(wú)顯著影響，說(shuō)明在一定量子輸出功率范圍內(nèi)（65 uw/cm2），是不會(huì)對(duì)臟器質(zhì)量產(chǎn)生明顯影響的。

此外，由于以雌性小鼠為研究對(duì)象，故對(duì)小鼠血清中卵泡刺激素（FSH）、黃體生長(zhǎng)激素（LH）的含量進(jìn)行測(cè)定研究，發(fā)現(xiàn)量子降脂儀不會(huì)對(duì)自然衰老小鼠的雌性激素產(chǎn)生影響，說(shuō)明量子降脂儀是安全的。

綜上所述，量子降脂儀能夠提高自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶的能力，及血清和肝臟中SOD、GSH-Px和CAT抗氧化酶活性，減少M(fèi)DA脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，降低機(jī)體的老化程度；并能夠提高自然衰老小鼠血清中端粒酶活性，延緩端粒縮短，發(fā)揮其抗衰老作用，但不會(huì)對(duì)自然衰老小鼠的臟器及雌激素產(chǎn)生影響。