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    酶制劑在飼料添加劑維生素A 含量測定中的應(yīng)用

    2019-12-26 05:01:34趙小陽虞哲高劉志英汪忠艷楊金樞劉文欣何劍洋
    中國畜牧雜志 2019年12期
    關(guān)鍵詞:乙酸酯微囊反式

    趙小陽,虞哲高,劉志英,汪忠艷,楊金樞,劉文欣,何劍洋

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,北京 100081;2.帝斯曼營養(yǎng)產(chǎn)品部中國研發(fā)中心,上海 201203;3.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司,北京 101102;4.廣州愛保農(nóng)飼料有限公司,廣東廣州 510080;5.浙江新和成股份有限公司,浙江杭州 312500;6.巴斯夫維生素有限公司,遼寧沈陽 110141;7.廈門金達(dá)威維生素有限公司,福建廈門 361028)

    維生素A 可保護(hù)上皮組織,維持正常視覺功能,促進(jìn)機(jī)體和骨骼的生長,防治角膜軟化、干眼病等[1]。因此,維生素A 多以乙酸酯形式添加到飼料中,用于促進(jìn)動物的健康生長發(fā)育。

    維生素A 用作飼料添加劑通常有明膠包埋和淀粉包埋2 種劑型,國標(biāo)分析方法(GB/T7292-1999)[2]主要針對微型膠囊技術(shù)、明膠包埋的產(chǎn)品,測定時(shí)需加入堿性蛋白酶,其作用是酶解包埋維生素A 的微囊外膜,使維生素A 釋放出來溶于乙醇溶液。事實(shí)上,除堿性蛋白酶外,其他商品化蛋白酶制劑如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶等也可用于明膠包埋產(chǎn)品中維生素A 含量的測定。對于淀粉包埋產(chǎn)品,尤其是為避免使用動物源性原料帶來的安全隱患及出口地區(qū)限制,市場上出現(xiàn)的采用雙重乳化工藝用淀粉包埋的飼料添加劑維生素A 產(chǎn)品,如何選擇更好的方法檢測其含量也是企業(yè)迫切需要了解的問題。

    本文旨在探討商品化淀粉酶制劑在飼料添加劑維生素A 產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用問題。為此,選用菠蘿蛋白酶檢測了明膠包埋的維生素A 產(chǎn)品含量,結(jié)果與用堿性蛋白酶測試的結(jié)果吻合,幫助企業(yè)擴(kuò)大了酶的選擇空間;通過用淀粉酶檢測淀粉包埋的維生素A 產(chǎn)品含量發(fā)現(xiàn),檢測結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確。

    1 材料與方法

    1.1 試劑 無水乙醇,國產(chǎn)優(yōu)級純試劑;乙腈、異丙醇為色譜純,購于Fisher Scientific 公司;菠蘿蛋白酶:20 萬U/g,淀粉酶:1 萬U/g,為國產(chǎn)試劑;全反式維生素A 乙酸酯對照品,購于Dr.Ehrenstorfer 公司,含量≥96.0% ;全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液,自配;全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,自配。

    1.2 儀器設(shè)備 分析天平(感量為0.000 1g、0.000 01g),德國Sartorius 公司(SQP QUINTIX224,BP211D);超聲波振蕩提取器,美國SmithKline 公司(BRANSON B-32);高效液相色譜儀,配有紫外吸收檢測器(或二極管矩陣檢測器),Agilent 1100;0.22 μm 微孔濾膜。

    1.3 試驗(yàn)步驟

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液:精確稱取80~90 mg(精確至0.000 01 g)全反式維生素A 乙酸酯對照品,置于50 mL 棕色容量瓶中,加入30~40 mL 無水乙醇,置于超聲水浴中處理2 min 使之完全溶解,用無水乙醇稀釋到刻度,搖勻。全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的濃度約為1 600~1 800 μg/mL(可密閉冷凍保存12 個(gè)月)。

    全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:準(zhǔn)確吸取全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液10 mL 于100 mL棕色容量瓶中,用無水乙醇稀釋到刻度,搖勻,配成160~180 μg/mL 的全反式維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(可密閉冷凍保存2 個(gè)月)。

    1.3.2 超聲提取時(shí)間的確定 GB/T7292-1999 方法中,試樣超聲提取10 min,但對于不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品,由于包埋工藝不同,提取效果有差異,因此首先分別對試樣超聲提取10、30、40 min,以確定最適時(shí)間(表1)。由表1 可知,超聲提取30 min,提取完全,結(jié)果穩(wěn)定,40 min 時(shí)測定值呈下降趨勢。

    1.3.3 酶解提取 根據(jù)酶的最佳酶活條件,選擇適合的提取溫度及提取溶液,見表2。堿性蛋白酶組依據(jù)GB/T7292-1999 方法:稱取200 mg 試樣,加入200 mg 堿性蛋白酶、10 mL 0.1%氨水溶液,45℃超聲波水浴中處理30 min,再用乙醇提取稀釋,用外標(biāo)法定量。菠蘿蛋白酶和淀粉酶組方法為:稱取100 mg(精確至0.000 1g)試樣,置于100 mL 棕色容量瓶中,加入100 mg 菠蘿蛋白酶、10 mL 水,于55℃超聲水浴中超聲提取30 min(或者加入100 mg 淀粉酶、10 mL 水,于70℃超聲水浴中超聲提取30 min),冷卻至室溫,加入無水乙醇振搖提取,然后用無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,用0.22 μm濾膜過濾,高效液相色譜檢測。

    1.3.4 直接提取 準(zhǔn)確稱取100 mg(精確至0.000 1g)試樣,置于100 mL 棕色容量瓶中,加入10 mL 水,45℃超聲水浴中超聲提取30 min,加入無水乙醇振搖提取,然后用無水乙醇稀釋至刻度,搖勻,用0.22 μm濾膜過濾,高效液相色譜檢測。

    1.4 色譜條件

    1.4.1 色譜條件的選擇 同GB/T7292-1999 方法[2]。色譜柱:LiChrospher 100RP-18,內(nèi)徑4.6 mm,長250 mm,粒度5 μm,或性能相當(dāng)者。流動相:乙腈+異丙醇+水=1 500+250+250。流速:1.0 mL/min。檢測波長:326 nm。進(jìn)樣量:5 μL。全反式維生素A 乙酸酯色譜峰見圖1,維生素A 乙酸酯色譜圖見圖2。

    圖1 全反式維生素A 乙酸酯色譜圖

    圖2 維生素A 乙酸酯色譜圖

    1.4.2 色譜柱的選擇 在色譜分離中,不同品牌的C18色譜柱對于順、反式維生素A 乙酸酯的分離情況是存在差異的,有些C18柱無法將順、反式維生素A 乙酸酯分開,由于維生素A 乙酸酯的含量是以順、反式維生素A 乙酸酯之和計(jì)算,因此是否將順、反式維生素A乙酸酯分開對檢驗(yàn)結(jié)果沒有影響。本研究使用的一種色譜柱能夠分離順、反式維生素A 乙酸酯,根據(jù)表3 測試結(jié)果,順式維生素A 乙酸酯占總維生素A 乙酸酯的量不超過9%。

    1.5 主要技術(shù)內(nèi)容分析論證

    1.5.1 線性范圍 準(zhǔn)確稱取103.2 mg維生素A乙酸酯對照品,用乙醇溶解定容至100.0 mL,制備成3 000 IU/mL 的維生素A 乙酸酯標(biāo)準(zhǔn)貯備液,稀釋成濃度為150~2 400 IU/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,進(jìn)樣5 μL 至高效液相色譜儀。如圖3 所示,當(dāng)維生素A 乙酸酯的濃度在150~2 400 IU/mL 時(shí),回歸系數(shù)為0.999 42,濃度和峰面積之間存在很好的線性。

    表1 不同提取時(shí)間的檢驗(yàn)結(jié)果

    表2 酶的提取條件

    表3 順、反維生素A 乙酸酯含量比值

    1.5.2 順式和反式維生素A 乙酸酯的定性試驗(yàn) 由于飼料級維生素A 乙酸酯都是化學(xué)合成的,在合成過程中,會生成少量維生素A 乙酸酯順式異構(gòu)體,同樣具有維生素A 的效價(jià),因此在計(jì)算時(shí)應(yīng)將維生素A 乙酸酯的順-反異構(gòu)體峰面積合并計(jì)算。

    稱取約85~90 mg 全反式維生素A 乙酸酯對照品,溶于100 mL 乙醇中。吸取5.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)貯備液于50 mL容量瓶中,用0.000 1 mol/L 的碘甲醇溶液稀釋至刻度,搖勻,放置10 min 后,滴加數(shù)滴1%硫代硫酸鈉溶液,使容量瓶中的黃色溶液褪色,將該溶液注入高效液相色譜儀,即得含全反式維生素A 乙酸酯和順式維生素A乙酸酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液,色譜圖見圖4。

    2 結(jié)果

    圖3 維生素A 乙酸酯不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液與峰面積響應(yīng)值線性關(guān)系

    圖4 全反式維生素A 乙酸酯和順式維生素A 乙酸酯色譜圖

    由表4 可知,用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解處理7 批次不同生產(chǎn)廠商生產(chǎn)的明膠包埋飼料添加劑維生素A 的微囊產(chǎn)品,得到的結(jié)果與標(biāo)示值非常吻合。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為商品化蛋白酶制劑在飼料添加劑維生素A 含量測試中的酶的選擇提供了空間。表4 還比較了用堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶及淀粉酶酶解處理4 批次用淀粉包埋的飼料添加劑維生素A 的微囊產(chǎn)品。從結(jié)果上看,用這3種酶酶解處理試樣獲得的結(jié)果無明顯差異。

    由表5 可知,對于用明膠包埋的維生素A 乙酸酯微囊,測試結(jié)果均低于產(chǎn)品標(biāo)示量,用淀粉包埋的測試結(jié)果與產(chǎn)品的標(biāo)示量相吻合。

    通過檢測7 家生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的飼料級維生素A 乙酸酯含量,檢測結(jié)果均不低于標(biāo)示值,用不同酶酶解提取檢測結(jié)果相對偏差不大于3%,表明檢測準(zhǔn)確度高。

    3 討 論

    在生產(chǎn)過程中將適量的維生素A 油、抗氧化劑及明膠通過噴霧干燥,即制成明膠包埋的維生素A 的微囊產(chǎn)品。由于交聯(lián)作用,部分維生素A 油油滴包裹在明膠基質(zhì)內(nèi),而明膠不溶于水,這些包裹在明膠內(nèi)的維生素A 油油滴不能釋放出來,導(dǎo)致用直接提取法測定維生素A 的提取率低,測定結(jié)果均低于產(chǎn)品的標(biāo)示量。而對于淀粉包埋的維生素A 的微囊產(chǎn)品,由于產(chǎn)品的基質(zhì)為可溶于水的淀粉,用水超聲處理后,淀粉擴(kuò)散到水中,破壞了產(chǎn)品的微囊結(jié)構(gòu),微囊內(nèi)的維生素A 易被有機(jī)溶劑所提取,測試結(jié)果與產(chǎn)品的標(biāo)示量相吻合。

    對于明膠包埋的維生素A 微囊產(chǎn)品,在樣品前處理過程中,通常采用皂化的方法(如飼料中維生素A的測定)或酶解的方法(如飼料添加劑維生素A 的測定)破膜后,再用有機(jī)溶劑提取。但對于明膠包埋的維生素A 微囊產(chǎn)品分析來說,關(guān)注點(diǎn)在于將明膠交聯(lián)的結(jié)構(gòu)打破,用有機(jī)溶劑將基質(zhì)內(nèi)的維生素A 提取出來。本研究用菠蘿蛋白酶酶解飼料添加劑維生素A 的微囊產(chǎn)品得到了滿意結(jié)果。

    表4 酶解提取檢測結(jié)果

    表5 直接提取測試結(jié)果

    淀粉酶酶解處理與其他2 種處理方法有所差異。這是因?yàn)樵嚇拥幕|(zhì)是淀粉,用堿性蛋白酶或菠蘿蛋白酶處理試樣起作用的是水,在試樣超聲過程中,包埋微囊的淀粉溶于水而分散于水中,維生素A 易被下一步加入的乙醇所提取。用淀粉酶酶解處理,除包埋微囊的淀粉溶于水而分散于水中之外,淀粉酶還能夠使大分子的淀粉結(jié)構(gòu)酶解成小分子的單糖結(jié)構(gòu)。在某些特定條件下,用商品化淀粉酶制劑測定淀粉包埋的飼料添加劑維生素A 的微囊產(chǎn)品還是有意義的。因?yàn)閷τ谟玫矸郯竦木S生素A 微囊,儲存條件不當(dāng)或放置時(shí)間過長,會使淀粉老化,試樣用水處理時(shí),會有部分淀粉不溶,導(dǎo)致部分維生素A 的油滴包裹在不溶淀粉基質(zhì)內(nèi)部,低估了實(shí)際的含量,而用淀粉酶酶解處理能解決淀粉老化導(dǎo)致含量偏低的問題。

    此外,順式維生素A 乙酸酯含量反映維生素A 乙酸酯生產(chǎn)工藝質(zhì)量,使用企業(yè)在送檢產(chǎn)品時(shí)可提出檢測順式維生素A 的含量。本研究中分離順反式維生素A 乙酸酯時(shí)所用的色譜柱為LiChrospher?100RP-18 4.6×250 mm 5 μm,但該品牌的色譜柱并非是本方法唯一指定的色譜柱,凡能達(dá)到相同結(jié)果的其他品牌色譜柱也能使用。

    4 小 結(jié)

    本研究通過對堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶及淀粉酶酶解提取方法的驗(yàn)證表明,對于明膠包埋的維生素A 乙酸酯,用堿性蛋白酶和菠蘿蛋白酶酶解可以提取完全,測試結(jié)果穩(wěn)定。對于淀粉包埋的維生素A 乙酸酯,根據(jù)淀粉易溶于水的性質(zhì),無論用哪種酶酶解,由于加水超聲提取,都能提取完全;也可以選擇不加酶,直接加水超聲提取,可降低試驗(yàn)成本,提高試驗(yàn)效率;如果淀粉包埋的產(chǎn)品檢測結(jié)果低于標(biāo)示值,可先查看其保質(zhì)期,之后最好用淀粉酶酶解處理再次檢測。本研究介紹的分析方法適用性強(qiáng),準(zhǔn)確度高,分析成本低,可為飼料級維生素A 的檢測提供有效的檢測依據(jù)。

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