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    嘔吐毒素降解菌的篩選、鑒定及應(yīng)用

    2019-12-26 05:01:32馬召穩(wěn)于思穎
    中國畜牧雜志 2019年12期
    關(guān)鍵詞:麩皮枯草芽孢

    梁 含,馬召穩(wěn),于思穎,李 旺

    (河南科技大學動物科技學院,河南洛陽 471023)

    嘔吐毒素學名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是鐮刀菌屬的一種次級代謝產(chǎn)物,特別是禾谷鐮刀菌。DON 廣泛存在于大麥、小麥、玉米及燕麥等飼料原料和成品飼料中,DON 污染飼料是引起動物飼料中毒的重要原因[1-2]。我國的飼料原料及飼料成品中DON 污染特別嚴重,農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心在全國對飼料原料及配合飼料的檢測發(fā)現(xiàn),2008—2014 年DON 的檢出率高達90% 左右,平均超標率為30%左右[3]。DON 可與核糖體60S 亞基的肽轉(zhuǎn)酶活性中心結(jié)合,觸發(fā)核糖體應(yīng)激反應(yīng),抑制DNA、RNA 和蛋白合成,誘導(dǎo)細胞凋亡,破壞腸道、免疫系統(tǒng),并且具有遺傳毒性,對動物健康產(chǎn)生嚴重影響,DON 是飼料中檢出率和超標率最高的一種真菌毒素[4]。有研究表明,豬對飼料中的DON 非常敏感,0.1~0.2 mg/kg 的劑量就會導(dǎo)致拒食和嘔吐,當攝入0.5 mg/kg DON 后,5~7 min 就會引起嘔吐拒食、生長能力下降及對傳染病的抵抗力下降[5]。中國《飼料衛(wèi)生標準》規(guī)定 DON 在豬配合飼料、犢牛配合飼料和泌乳期動物配合飼料中最高限量為≤1 mg/kg[6]。

    DON 化學性質(zhì)很穩(wěn)定,具有很強的熱抵抗力,在加工、儲存及高溫高壓下很難對其毒性造成破壞。目前對DON 的降解方法主要有物理脫毒法、化學脫毒法和生物轉(zhuǎn)化法。物理脫毒主要采用霉菌毒素吸附法,包括黏土、硅鋁酸鹽、硅藻土、酯化甘露聚糖、葡甘露聚糖等。但霉菌毒素吸附劑對DON 的吸附效率太低,不足5%[7]?;瘜W反應(yīng)法是利用DON 在強堿、強酸等作用下會轉(zhuǎn)化成無毒物質(zhì),但強堿、強酸和強氧化劑不僅會大大破壞飼料的口感和營養(yǎng),也會帶來飼料的二次污染。與物理、化學脫毒方法相比,生物轉(zhuǎn)化法不會引入其他化學試劑的污染也不會造成原料營養(yǎng)的丟失[8]。由于生物轉(zhuǎn)化法具有高效、環(huán)保、針對性強等優(yōu)點,成為未來用于霉菌毒素脫毒的一種有效途徑。研究報道,已從多種樣品中(如土壤、受污染玉米、牛瘤胃液、雞腸道內(nèi)容物等)篩選到對DON 具有降解能力的菌株[9],并對單菌的降解能力進行了研究。本試驗擬以多種培養(yǎng)基、不同的培養(yǎng)方式從不同類型的樣本中篩選對DON 降解能力高的新菌株,研究其降解DON 的能力,并根據(jù)微生物的協(xié)同作用將不同菌種組合應(yīng)用到飼料原料的脫毒處理中,得到能有效降解DON 的天然飼料菌種組合,為飼料中DON 的去除提供技術(shù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗樣品 土壤、淤泥和發(fā)霉秸稈樣品采自河南科技大學;雞腸道內(nèi)容物、鯽魚腸道內(nèi)容物、牛瘤胃液、豬糞和牛糞等樣品采自河南周邊養(yǎng)殖場;自制發(fā)霉玉米和530 實驗室提供的發(fā)霉苜蓿樣品,共10 份。

    1.1.2 主要試劑 DON 標準品購于天津一方科技有限公司,純度≥95.0%;向10 mg DON 標準品中加入10 mL滅菌水,放于4℃下保存、備用。DON 的ELISA 常規(guī)慢速檢測試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司;聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)所需試劑購于TaKaRa 公司;細菌基因組抽提試劑盒購于北京天根生化科技有限公司。

    1.1.3 主要儀器 酶標儀(Multiskan FC)、Bio-metro PCR 儀;高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、電泳槽、離心機、凝膠成像系統(tǒng)、顯微鏡、恒溫搖床等。

    1.1.4 主要培養(yǎng)基 LB 固體培養(yǎng)基:酵母提取物 5 g,胰蛋白胨 10 g,NaCl 10 g,瓊脂 15 g,加入 1 L 的無菌蒸餾水中,121℃高壓滅菌20 min。使用前加DON標準品使其終濃度為2 μg/mL。LB 液體培養(yǎng)基:除無瓊脂外,成分同LB 固體培養(yǎng)基。使用前加DON 標準品使其終濃度為1 μg/mL。

    NA 固體培養(yǎng)基:10 g 蛋白胨,5 g NaCl,3 g 牛肉粉,瓊脂15 g,溶解于 1 000 mL 無菌蒸餾水中,121℃下滅菌20 min。使用前加DON 標準品使其終濃度為2 μg/mL。NA液體培養(yǎng)基:除無瓊脂外,成分同NA 固體培養(yǎng)基。使用前加DON 標準品使其終濃度為1 μg/mL。

    MRS 固體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,牛肉膏10 g,MgSO4·7H2O 0.58 g,MnSO4·4H2O 0.25 g,吐 溫1 g,K2HPO42 g,檸 檬 酸三胺2 g,乙酸鈉5 g,瓊脂15 g,蒸餾水定容至1 L,121℃高壓滅菌20 min。使用前加DON 標準品使其終濃度為2 μg/mL。MRS 液體培養(yǎng)基:除無瓊脂外,成分同MRS 固體培養(yǎng)基。使用前加DON 標準品使其終濃度為1 μg/mL。

    1.1.5 引物 上海生工生物工程有限公司合成試驗中菌株16S rDNA 片段的擴增所需要的通用引物。上游引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′,下游引物:5′-AAGGAGGTG ATCCAG CC-3′。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 樣品的處理 所采樣品各取1 g,每個樣品中加入10 mL 無菌水,充分震蕩得懸浮液,備用。

    1.2.2 DON 降解菌株的初篩 取上述混懸液100 μL 分別涂布于含有DON 的3 種改良固體培養(yǎng)基中,好氧、厭氧2 種方式培養(yǎng),置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,挑取在培養(yǎng)基上生長的形態(tài)不同的單菌落進行純培養(yǎng)。

    1.2.3 DON 降解菌株的純化 將初篩得到的形態(tài)不同的單菌落劃線于新的與其相對應(yīng)的改良固體培養(yǎng)基平板上,如此反復(fù)劃線3~4 次以純化菌株。

    1.2.4 DON 降解菌株的復(fù)篩 將上述經(jīng)過純化的菌株接種到含1 μg/mL DON 的改良液體培養(yǎng)基中,好氧菌在37℃、180 r/min 下培養(yǎng)直至菌液渾濁,厭氧菌靜置于37℃恒溫箱中。設(shè)置空白對照。用ELISA 測空白對照和菌液中DON 含量,對初篩菌種進行復(fù)篩,并保存降解能力強的DON 降解菌。

    1.2.5 DON 降解菌的鑒定 形態(tài)學觀察:將通過復(fù)篩得到的菌株劃線接種于無機鹽固體培養(yǎng)基平板上,在37℃下培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)、色澤和菌體特征。挑取新鮮的單菌落進行革蘭氏染色,顯微鏡下觀察菌體生理形態(tài)。

    16S rDNA 序列分析鑒定:以25 μL 體系進行PCR擴增。由上海生工生物工程有限公司進行DNA 擴增的序列測定。將測序結(jié)果在GenBank 中進行BLAST 比對,對每個菌種選取15 個同源性在98%以上不同命名的菌株,下載這些菌株的16S rDNA 序列,用Mega 軟件構(gòu)建系統(tǒng)演化樹,比較菌種之間的親緣關(guān)系,確定其種屬。

    PCR 反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃ 2 min;變性94℃30 s,復(fù)性56℃ 30 s,延伸72℃ 1 min 30 s,35 個循環(huán);終延伸72℃ 10 min,4℃保存。

    PCR 反應(yīng)體系25 μL:上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,10×Ex TaqBuffer 2.5 μL,dNTP 2 μL,模板(基因組DNA)1 μL,ExTaq 酶 0.5 μL,ddH2O 17 μL。

    1.2.6 DON 降解菌的應(yīng)用 選擇LB01(枯草芽孢桿菌)、NA06(解淀粉芽孢桿菌)和MRS16(植物乳桿菌)作為發(fā)酵菌種,分別培養(yǎng)至6×109、2×109、3.5×109CFU/mL。通過菌種組合試驗設(shè)計接種于無機鹽液體培養(yǎng)基中,經(jīng)過一系列單因素發(fā)酵試驗,確定發(fā)酵參數(shù):發(fā)酵溫度37℃,10 mL 菌液或組合菌液(即單菌種10 mL、雙菌種組合各5 mL、三菌種組合各3.3 mL 以此類推)、40 mL無菌水加入到100 g 天然飼料麩皮中,每個處理設(shè)置3個重復(fù),以不加發(fā)酵液處理的為空白對照。分別于發(fā)酵48、72、96 h 時取樣,參照羅俊聰?shù)萚10]用ELISA 試劑盒檢測發(fā)酵麩皮中 DON 毒素含量,重復(fù)測定3 次取平均值。

    1.2.7 DON 的測定及降解率 不同發(fā)酵處理的麩皮樣品分別在48、72、96 h 取樣,用ELISA 方法測定其DON 含量,DON 降解率=(空白組DON 含量-樣本組DON 含量)/空白組DON 含量×100%

    2 結(jié)果

    2.1 菌株的篩選 用3 種含有DON 的改良固體培養(yǎng)基以好氧和厭氧2 種方式共篩選到單菌落80 株。將這些菌株分離純化后接種含有DON 的改良液體培養(yǎng)基中,好氧菌在37℃、180 r/min 下培養(yǎng)直至菌液渾濁,厭氧菌靜置于37℃恒溫箱中培養(yǎng),至底層菌體出現(xiàn)沉淀。用ELISA 測空白對照和菌液中DON 含量,得到16 株對DON 有降解能力的菌株,如表2 所示。根據(jù)培養(yǎng)基的不同進行編號,來自LB 培養(yǎng)基的編號為LB01、LB02、LB03、LB04;來自NA 培養(yǎng)基的編號為NA05、NA06、NA07、NA08、NA09;來 自MRS培養(yǎng)基的編號為MRS10、MRS11、MRS12、MRS13、MRS14、MRS15、MRS16。根據(jù)降解率的高低和培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式的不同選擇LB01、NA06 和MRS13 號菌株進行后續(xù)鑒定和應(yīng)用。

    表1 不同菌株對DON 的降解率

    2.2 菌株的形態(tài)學特征 如圖1 所示,所篩菌株中LB01號菌株菌落形態(tài)呈乳白色,不透明,表面干燥沒有光澤,中間褶皺邊緣不整齊;NA06 號菌株菌落呈白色不透明,有隆起,不透明,干燥,表面粗糙,菌落邊緣不規(guī)則;MRS13 號菌株菌落呈乳白色半透明,菌落凸起邊緣整齊,表面濕潤且光滑,直徑在0.4~2.0 mm。

    圖1 菌株的菌落形態(tài)

    如圖2 所示,LB01 號菌株染色結(jié)果為陽性,在顯微鏡下觀察菌體呈長桿狀,兩端鈍圓,以成對或鏈狀排列,孢囊無明顯膨脹,無伴孢晶體。NA06 號菌株為革蘭氏陽性菌,長桿狀,有芽孢,有莢膜。MRS13 號菌株為革蘭氏陽性菌,在顯微鏡下觀察菌體呈短桿狀,且其菌體的排列方式有單個和鏈狀排列,無芽孢。

    圖2 革蘭氏染色圖片

    2.3 分子生物學鑒定 使用細菌基因組DNA 提取試劑盒從新鮮菌液中提取細菌基因組DNA,以菌株LB01、NA06、MRS13 的基因組DNA 為模板進行16S rDNA保守序列擴增。由圖3 可知,在1 000~2 000 bp 擴增到1 條特異性條帶,與細菌16S rDNA 大小相符。將擴增產(chǎn)物進行序列測定。序列測定結(jié)果進行BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對。LB01 號與枯草芽孢桿菌菌株MSC46(KM222187.1)同源性最高達到99%。NA06 號菌株與解淀粉芽孢桿菌菌株EnBalf13(KP792638.1)同源性最高達到99%。MRS13 號菌株與植物乳桿菌菌株Sourdough-H04(MG754699.1)同源性最高達到99%。

    圖3 菌株的 16S rDNA 片段 PCR 擴增結(jié)果

    2.4 基于16S rDNA 序列的系統(tǒng)遺傳發(fā)育樹分析 由圖4 可知,LB01 號菌株與KM222187.1(枯草芽孢桿菌)親緣關(guān)系最近,結(jié)合其菌落特征、菌體特征和DNA 同源性比對結(jié)果,將LB01 號菌株確認為枯草芽孢桿菌。NA06 號菌株與KP792638.1(解淀粉芽孢桿菌)親緣關(guān)系最近,結(jié)合其菌落特征、菌體特征和DNA 同源性比對結(jié)果,將NA06 號菌株確認為解淀粉芽孢桿菌。MRS13 號菌株與MG754699.1(植物乳桿菌)親緣關(guān)系最近,結(jié)合其菌落特征、菌體特征和DNA 同源性比對結(jié)果,將MRS13 號菌株確認為植物乳桿菌。

    2.5 菌株對麩皮中DON 毒素的降解 空白對照組DON含量為701.1 μg/kg。各樣品降解率結(jié)果如表2 所示,LB01 和MRS13 的組合對物料中DON 降解效果最好,在發(fā)酵48 h 時降解率最高達到71%。說明枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌在對DON 降解時具有一定的協(xié)同作用。

    圖4 菌株的親緣關(guān)系

    表2 組合菌種發(fā)酵對麩皮中DON 的降解

    3 討 論

    由于DON 給養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害巨大,物理、化學處理方法又各有缺點,故生物處理DON 成為研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn),許多微生物如酵母菌、細菌、真菌等可以將DON 轉(zhuǎn)化為其他無毒或低毒物質(zhì),達到去除或減少飼料中的霉菌毒素的目的[11]。譚劍等[12]從受污染的玉米中篩選到1 株能降解DON 菌株,經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌。李曉鳳等[13]從土壤中篩選得到1 株能降解DON 的菌株,經(jīng)鑒定為發(fā)酵型腸桿菌。本試驗從土壤、淤泥、發(fā)霉玉米、腸道內(nèi)容物等樣品中篩選出16 株能夠降解DON 的菌株,其中從土壤樣品中篩選到2 株、淤泥樣品中3 株、雞腸道內(nèi)容物2 株、自制發(fā)霉玉米5株、牛糞2 株、豬糞和發(fā)霉秸稈分別為1 株,經(jīng)鑒定降解DON 的微生物菌種主要為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和植物乳桿菌,與上述文獻相符。

    這些菌種對DON 的降解會隨著菌種不同和DON濃度、來源等出現(xiàn)較大變化。程亮等[14]篩選得到了1株假單胞桿菌,在 30℃與含有100 μg/mL 的 DON 無機鹽培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)14 d 后,降解率可達56.61%。徐劍宏等[11]分離出1 株德沃斯氏菌DDS-1,將其應(yīng)用到DON 濃度為25 μg/kg 的飼料中,菌株對DON 的降解率達到75.47%。微生物菌種可以通過自身代謝過程所產(chǎn)生的一系列物質(zhì)最終將DON 轉(zhuǎn)化成對人和動物無害的物質(zhì)。Garda-Buffon 等[15]研究報道,真菌類和乳酸菌類菌株對DON 主要是具有吸附作用。目前發(fā)現(xiàn)的微生物對DON 生物降解主要包括2 大類:腸道或瘤胃厭氧菌將DON 轉(zhuǎn)化為去環(huán)氧化合物DOM-1;好氧菌將DON 氧化成3-酮-DON,同時生成3-epi DON[16]。由此可以推測,本試驗對DON 降解最高的組合即枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌組合,對DON 的降解機理既有生物轉(zhuǎn)化作用,又有吸附作用。

    本試驗以麩皮中的DON 作為降解對象,其含量和存在方式較標準液有很大區(qū)別。試驗所篩菌種在初篩和復(fù)篩時均是對DON 標準品的降解,但是在對麩皮中的天然DON 進行降解時差異很大。通過菌種的組合可提高DON 的降解率,說明枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和植物乳桿菌等菌種具有降解天然DON 的能力,不同菌種在對天然DON 降解時有協(xié)同作用。

    4 結(jié) 論

    本試驗中,初篩和復(fù)篩得到具有降解能力的菌株16 株,降解率最高達66.7%;選擇其中3 株,經(jīng)形態(tài)學和分子生物學鑒定,確定為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和植物乳桿菌;對其進行不同組合發(fā)酵麩皮,枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的組合對發(fā)酵麩皮中DON 的降解最高,在48 h 達71%。

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