興義鴨MEF2C 基因啟動子區(qū)序列克隆與分析

楊華婷，李 輝，李興才，趙忠海，師新彩

（貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025）

肌細胞增強因子2（Myocyte Enhancer Factor 2，MEF2）屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MADS-Box 家族，是一種特定的轉(zhuǎn)錄因子。在脊椎動物中，MEF2基因家族由4 個基因組成，包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D，它們在肌肉生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和分化、肝纖維化方面均有重要作用[1-2]。MEF2 是廣泛存在于肌肉細胞的DNA 結(jié)合活性因子，可與大多數(shù)肌肉發(fā)育相關(guān)基因的啟動子或增強子結(jié)合，激活其活性，對肌肉發(fā)生具有重要作用[3]。Brand[4]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2 能和肌肉肌酸酶（Muscle Creatine Kinase，MCK）基因啟動子中A/T DNA 序列特異性結(jié)合，增強MCK 的轉(zhuǎn)錄活性。MEF2 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其特定的結(jié)構(gòu)可使它與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用。溫見燕等[5]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2C 可以通過作用于DOK5 啟動子區(qū)的MEF2 結(jié)合位點，調(diào)節(jié)DOK5 的轉(zhuǎn)錄活性；王煒[6]報道，MEF2C 與IPO13 啟動子上E-BOX 元件結(jié)合之后，促進了IPO13 的表達。臨床上MEF2C 已成為治療人類先天性心臟病[7]、膠質(zhì)母細胞瘤[8]以及心血管發(fā)育異常[9-10]等疾病的靶向基因。畜禽中相關(guān)研究報道，MEF2C基因中新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性（RFLP/Bsr I）可能成為牛胴體和肉質(zhì)性狀的潛在遺傳標記[11]，MEF2C基因多態(tài)位點可以作為黃牛生長早期輔助標記選擇的分子標記[12]。程波[13]確定了MEF2C基因與山羊臂三頭肌肌纖維直徑和密度分別呈極顯著負相關(guān)和顯著正相關(guān)。這些研究主要集中在MEF2C基因多態(tài)性、表達差異及關(guān)聯(lián)性分析等方面。

近年來，對特定基因的啟動子研究層出不窮，但關(guān)于MEF2基因家族的啟動子研究報道較少，且關(guān)于鴨MEF2C基因的研究報道鮮見。因此，本實驗以興義鴨作為研究對象，直接測序結(jié)合DNAStar 篩選啟動子區(qū)SNPs 位點；生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測該序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和核心啟動子區(qū)，分析其SNPs 位點對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的影響，并對SNPs 位點與屠宰性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，以期為MEF2C基因功能的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 隨機選取來自貴州省興義市落火坪村52只55 日齡的飼養(yǎng)環(huán)境一致、健康的興義鴨作為實驗材料。根據(jù)《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計方法》（NY/T 823-2004）進行屠宰測定，其余樣品由冰盒帶回實驗室，根據(jù)組織基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明書步驟分別提取52 只興義鴨組織DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 效果，利用紫外分光光度計檢測DNA 濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。DNA 提取試劑盒、DL2000 Marker、Goldview Ⅰ型核酸染料等主要試劑購自天根生化科技（北京）。

1.2 引物設(shè)計及PCR 擴增 根據(jù)GenBank 上已公布的鴨MEF2C基因序列（登錄號：NW_004677103.1），利用Primer3.0 設(shè)計1 對特異性引物擴增MEF2C基因啟動子區(qū)域。上游引物：5'-TGACACATTCTGCGTTACGG-3'，下游引物：5'-AGCCTCCTTCTTCAGCACTT-3'，擴增片段長度為1 780 bp，退火溫度62℃。以DNA 樣品為模板進行PCR 擴增。PCR 擴增為30 μL 體系：2×Taq PCR Master Mix（With Dye）15 μL，上、下游引物各2 μL、基 因 組DNA（100 ng/μL）2 μL、ddH2O 9 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，62℃退火35 s，72℃延伸55 s，31 個循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，合格樣送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行PCR 直接測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 鴨MEF2C基因核心啟動子預(yù)測 運用3 種生物信息學(xué)軟件預(yù)測鴨MEF2C基因核心啟動子區(qū)域，其在線軟件分別為Promoter Scan：https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/；Neural Network Promoter Prediction：http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html；Promoter 2.0：http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/。

1.3.2MEF2C基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測 運用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測MEF2C基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點以及可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，3 種在線軟件分別是Alibaba2.1：http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html；JASPAR：http://jaspar.binf.ku.dk/Tfsitescan：http://www.ifti.org/。

1.4 SNPs 篩選及關(guān)聯(lián)性分析 擴增好的PCR 產(chǎn)物送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進行雙向測序，利用DNASTAR 軟件等對測序結(jié)果進行拼接比對，篩選SNPs 位點。運用SPSS 18.0 軟件進行基因多態(tài)性與屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因PCR 擴增結(jié)果 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測MEF2C基因啟動子片段，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察可知，PCR 產(chǎn)物擴增條帶特異性良好，明亮清晰、單一無雜帶，且與預(yù)期目的片段大小相符（圖1），可用于下一步分析。

圖1 興義鴨MEF2C 基因啟動子區(qū)PCR 結(jié)果

2.2 序列分析 Megalign、SeqMan 程序BLAST 分析發(fā)現(xiàn)，興義鴨MEF2C基因啟動子區(qū)存在8 個SNPs 位點，分別為T-190A、A-232G、A-285G、A-617T、G-1420A、A-1437C、T-1504G、A-1524G（圖2）。

圖2 8 個SNPs 位點測序峰圖

2.3MEF2C基因核心啟動子預(yù)測結(jié)果 生物信息學(xué)軟件預(yù)測MEF2C基因核心啟動子區(qū)域，結(jié)果表明，MEF2C基因啟動子具備顯著的核心啟動子識別特征。各在線軟件預(yù)測核心啟動子區(qū)域結(jié)果見表1。3 種在線軟件均預(yù)測得到MEF2C基因核心啟動子區(qū)，Promoter 2.0 軟件在-800 bp 處預(yù)測出1 個極大可能性的核心啟動子區(qū)域；Neural Network Promoter Prediction 軟件在-1 229～-1 279 bp 范圍內(nèi)也預(yù)測出了1 個高評分的核心啟動子區(qū)域。大部分SNPs 位于核心啟動子區(qū)域內(nèi)，由此推測這些突變位點可能影響著MEF2C基因的表達調(diào)控。

表1 核心啟動子區(qū)分析結(jié)果

2.4MEF2C基因SNPs 突變對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的影響不同在線軟件分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MEF2C基因啟動子區(qū)突變位點造成重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點發(fā)生明顯變化（表2）。通過Alibaba2.1 在線軟件預(yù)測得到MEF2C基因啟動子區(qū)堿基突變前后轉(zhuǎn)錄因子的變化結(jié)果（表3），-190處發(fā)生T＞A 突變，可能導(dǎo)致原來的HOXA4、GCN4 2個轉(zhuǎn)錄因子消失而重新生成了新的轉(zhuǎn)錄因子Oct-1 的結(jié)合位點；-232 位點（A＞G）可能引起原有的Pit-1a 轉(zhuǎn)錄因子消失；在-1420 位點（G＞A），突變可能使原來的IRF-1 轉(zhuǎn)錄因子改變成了ICSBP。因此，這些SNP位點導(dǎo)致一部分原有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的消失和新轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的生成，很有可能對MEF2C基因表達產(chǎn)生重要影響。

表2 不同軟件對MEF2C 基因啟動子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預(yù)測結(jié)果

2.5MEF2C基因啟動子SNPs 與屠宰性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)合Chromas、SeqMan 2 種軟件分析發(fā)現(xiàn)，有6 個多態(tài)位點僅檢測出1 種基因型，分別是A-232G（GG）、A-285G（GG）、A-617T（TT）、A-1437C（CC）、T-1504G（TG）、A-1524G（AG），該6 個突變位點不具備基因多態(tài)性，所以不列入分析討論。而另外的T-190A、G-1420A 位點在本實驗群體中存在TT、TA（GA、AA）2 種基因型，2 個多態(tài)位點的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量見表4。T 等位基因為T-190A 位點優(yōu)勢等位基因，該等位基因頻率高達0.817 3；同時經(jīng)χ2適合性檢驗得到2 個多態(tài)位點符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。T 檢驗分析T-190A、G-1420A2 個位點與屠宰性狀的相關(guān)性，結(jié)果見表5。T-190A 位點對活重的影響達到顯著水平（P＜0.05），對屠體重（P=0.096）、半凈膛（P=0.095）、半凈膛率（P=0.076）3 個屠宰指標的影響接近顯著水平，而對其他屠宰性狀無顯著影響。G-1420A 位點對腿肌率的影響達到顯著水平（P＜0.05）。

表3 MEF2C 基因啟動子區(qū)SNP 突變前后轉(zhuǎn)錄因子變化結(jié)果

表4 MEF2C 基因啟動子多態(tài)位點的遺傳特性

3 討 論

MEF2C基因?qū)儆贛EF2基因家族成員，廣泛存在許多細胞和組織中，對細胞分化、肌肉發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。啟動子是位于基因中轉(zhuǎn)錄起始位點上游的特定DNA 片段，是基因中不可缺少的部分，在基因的表達過程中，轉(zhuǎn)錄起始階段最為關(guān)鍵，這一階段主要發(fā)生RNA 聚合酶與啟動子的相互作用，啟動子結(jié)構(gòu)改變會影響其與RNA 聚合酶的親和力、啟動子序列的變異，直接影響基因的表達水平。王帥[14]報道，MEF2C基因啟動子的低頻突變可作為預(yù)防和治療心肌梗死的新靶點；邱進等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2C基因啟動區(qū)SNPs位點大大提高其轉(zhuǎn)錄活性而使得人類先心病發(fā)病率上升；Materna 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2C 對血管發(fā)育的需求僅次于心臟的需求，小鼠在敲除MEF2C基因之后出現(xiàn)心功能不全而導(dǎo)致血管重構(gòu)失??；Jin 等[16]研究表明，生肌決定因子MyoD 參與MEF2C基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，突變或缺失都會影響其轉(zhuǎn)錄活性。目前，關(guān)于畜禽類MEF2C基因啟動子相關(guān)報道較少。本實驗在興義鴨MEF2C基因啟動子區(qū)鑒定得到8 個SNPs，對興義鴨屠宰性狀均產(chǎn)生影響。不同軟件預(yù)測核心啟動子區(qū)結(jié)果有差異。本研究綜合多個軟件分析，大大提高了預(yù)測結(jié)果的準確性。本實驗得到的突變位點處于核心啟動子區(qū)域，其突變可能在調(diào)控MEF2C基因表達中發(fā)揮重要作用，T-190A 可能消除了HOXA4 和GCN4 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點，新產(chǎn)生Oct-1 轉(zhuǎn)錄因子。HOXA4 轉(zhuǎn)錄因子是HOX基因家族成員之一，對細胞分化、增殖及信號傳導(dǎo)等產(chǎn)生重要影響[17]，GCN4 轉(zhuǎn)錄因子具有特異性識別DNA 序列的功能，從而影響許多基因的轉(zhuǎn)錄[18]，新生的Oct-1 既具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，又具有激活作用，Oct-1 本身直接與啟動子結(jié)合，又可以結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄因子作用在啟動子上來調(diào)控基因的表達[19]。T-190A、G-1420A 對附近的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點影響顯著，說明2個SNPs 位點可直接影響轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控序列的結(jié)合。

表5 T-190A、G-1420A 與興義鴨屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析

本研究發(fā)現(xiàn)，T-190A 突變位點對轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點影響較大，TT 基因型頻率遠遠大于TA 基因型頻率，T 為該突變位點的優(yōu)勢等位基因。關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，得到T-190A 與活重有顯著關(guān)聯(lián)，而與屠體重、半凈膛、半凈膛率的關(guān)聯(lián)性接近顯著，G-1420A 與腿肌率的關(guān)聯(lián)性達到顯著水平，與其他性狀未達到顯著水平，可能是實驗群體樣本數(shù)少，需增加樣本數(shù)進行更深入的研究。T-190A、G-1420A 突變可能是重要的功能性SNPs 位點，MEF2C基因SNPs 研究結(jié)果為進一步分析MEF2C基因啟動子功能提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

興義鴨MEF2C啟動子序列測定共檢測到8 個SNPs，生物信息學(xué)預(yù)測得到MEF2C基因核心啟動子區(qū)域，其中部分SNPs 位點可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的改變，從而導(dǎo)致基因表達的改變。T-190A 和T-1420A2 個突變位點可能是重要的功能性突變位點，對MEF2C基因表達的影響需要加大樣本量來作進一步研究。本研究對MEF2C基因啟動子區(qū)SNP 的結(jié)果為進一步分析MEF2C基因啟動子功能和闡明MEF2C基因表達調(diào)控奠定基礎(chǔ)。