煙草病害的相關(guān)檢測技術(shù)進(jìn)展

摘要：近年來，煙草病害發(fā)生十分普遍，且危害較大，給煙葉生產(chǎn)帶來了巨大損失。因此，建立各種煙草病害的檢測鑒定方法十分必要。本文論述了主要煙草病害的檢測鑒定方法，包括病毒病、青枯病和赤星病。

關(guān)鍵詞：煙草病害;病毒病;青枯病;赤星病

煙草原產(chǎn)于美洲，于17世紀(jì)初傳入我國，已有近400年的種植歷史。隨著全球環(huán)境氣候的變化，煙草病害也日益嚴(yán)重，給煙葉生產(chǎn)及煙農(nóng)造成了經(jīng)濟(jì)損失。例如，20世紀(jì)80年代，煙草病毒病在全國范圍內(nèi)大流行，導(dǎo)致全國煙葉嚴(yán)重減產(chǎn)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。在我國，發(fā)生較為廣泛的煙草病害主要包括煙草病毒病、赤星病以及青枯病等。為了科學(xué)防治煙草病害，降低其對煙草生產(chǎn)的危害，建立起具有針對性的檢測方法，在煙草病害發(fā)生的早期及時(shí)進(jìn)行鑒別，將為科學(xué)制定防治策略提供依據(jù)，并將有助于研究病害生物的流行病學(xué)規(guī)律。

1? 煙草病毒病的檢測

我國煙葉生產(chǎn)上常見的煙草病毒病有20余種，其中煙草普通花葉病毒、黃瓜花葉病毒、馬鈴薯Y病毒造成的危害最為嚴(yán)重。由于煙草病毒缺乏細(xì)胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)極其微小，只能在活細(xì)胞中增殖。因此，煙草病毒鑒定專業(yè)性強(qiáng)、操作難度大，對人員、設(shè)備的要求高。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)普遍采用的煙草病毒檢測方法有掃描電鏡檢測技術(shù)、免疫學(xué)檢測法和分子生物學(xué)檢測方法。

1.1? 電鏡檢測方法

1939年，德國科學(xué)家首次通過電鏡觀察到煙草花葉病毒并拍下照片，從此以后，電鏡成為研究植物病毒的通用方法，該方法通過運(yùn)用負(fù)染色技術(shù)、免疫吸附技術(shù)、超薄切片技術(shù)以及掃描電子顯微鏡技術(shù)，能夠通過形態(tài)觀察，直觀、準(zhǔn)確地鑒別煙草病毒，是一種簡單、靈敏的病毒檢測方法，能夠區(qū)分病毒的種類甚至株系。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃遵錫等通過電鏡觀察到PVY、TMV、TEV、PVX等煙草病毒的病毒粒體，以及粒體上的套環(huán)結(jié)構(gòu)。但是該方法的缺陷是不僅電鏡設(shè)備昂貴，而且病毒樣本的制片以及電鏡的操作較為復(fù)雜，無法分辨球狀病毒。此外，植物破碎細(xì)胞器容易對電鏡檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，從而影響結(jié)果。

1.2? 免疫學(xué)檢測方法

免疫學(xué)檢測方法是利用抗原抗體特異性結(jié)合的檢測方法，是國內(nèi)外檢測植物病毒的主流方法之一，具有操作簡單、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫膠體金檢測法、免疫毛細(xì)管區(qū)帶電泳檢測法和免疫 PCR檢測法。黃遵錫等人利用免疫學(xué)檢測方法成功鑒定了PVX、PVY、TMV、TEV、CMV等煙草病毒。該方法的局限在于無法檢測抗原性較差的病毒、RNA病毒以及類病毒;靈敏性較低，無法檢出含量較低的病毒，容易發(fā)生漏檢。

1.3? 分子生物學(xué)檢測方法

分子生物學(xué)在21世紀(jì)得到了較大的發(fā)展，可用于煙草病毒檢測的方法有核酸分子雜交技術(shù)、PCR技術(shù)、dsRNA技術(shù)、siRNA高通量測序技術(shù)等。核酸分子雜交，又稱為探針檢測技術(shù)，是通過堿基互補(bǔ)配對形成穩(wěn)定的雙鏈的過程，兩條鏈?zhǔn)鞘褂玫奶结樇按郎y核酸序列，核酸分子雜交主要包括Southern雜交、Northern雜交以及點(diǎn)雜交。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)檢測植物病毒，是通過擴(kuò)增植物病毒基因組，再分析擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，具有特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。基于PCR技術(shù)，又衍生出了逆轉(zhuǎn)錄PCR、免疫捕捉逆轉(zhuǎn)錄PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR等方法。dsRNA電泳技術(shù)是從植物病毒中提取得到dsRNA，通過電泳得到電泳圖譜，利用圖譜鑒別病毒種類。siRNA高通量測序技術(shù)，是通過利用測序技術(shù)對煙草的小RNA進(jìn)行高通量測序，再利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行比對，從而鑒別煙草病毒的方法。

2? 煙草青枯病的檢測

煙草青枯病的病原體是勞爾氏菌屬假單胞桿菌，它是一種以植煙土壤為傳播媒介的病原菌，在適宜的土壤環(huán)境中，這種病菌可以在土壤中較長時(shí)間的存活，甚至可以存活整個(gè)冬天。一般情況下，植煙土壤中青枯病原菌越多，煙葉病害也就相對越嚴(yán)重。因此，有必要建立起分離純化和檢測土壤中青枯病原菌數(shù)量的方法。目前青枯病原菌的檢測方法包括有常規(guī)方法、指示植物法、免疫學(xué)法以及分子生物學(xué)法等4種。常規(guī)方法是根據(jù)青枯病菌所需要的一種或者幾種特殊營養(yǎng)物質(zhì)，通過半選擇培養(yǎng)基和稀釋平板法分離出青枯病原菌，然后在培養(yǎng)基中對其菌落形態(tài)、顏色等生理特征進(jìn)行觀察，以此鑒定病原菌。指示植物法是鑒別青枯病菌的另一種傳統(tǒng)方法，是在含有目標(biāo)病原菌的土壤中種植指示植物，通過觀察指示植物感染后的癥狀，從而判斷是否有病原菌的存在。常規(guī)方法、指示植物法都因檢測周期較長，應(yīng)用比較少。免疫學(xué)檢測法（ELISA）是利用抗體與青枯病菌細(xì)胞的抗原結(jié)合，發(fā)生特異反應(yīng)，來區(qū)別于其它微生物，該方法反應(yīng)靈敏、操作簡單，但免疫學(xué)法受抗體質(zhì)量限制。分子生物學(xué)法主要是使用核酸分子雜交技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是當(dāng)前測定青枯病原菌的主要方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。

3? 煙草赤星病的檢測

赤星病是煙草生產(chǎn)中后期發(fā)生的葉斑病，對煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量影響都很大。與青枯病菌不同，煙草赤星病是由鏈格孢菌侵犯所引起的。鏈格孢菌是一種真菌，菌絲無色透明，菌絲進(jìn)入來年春季后長出分生孢子，這些無色的孢子將成為煙草的初侵染源。自1892年赤星病首次由Ellis和Everhart報(bào)道以來，曾幾次成為世界煙葉生產(chǎn)的嚴(yán)重病害。20世紀(jì)60年代，赤星病在山東、河南等煙區(qū)猖獗為害。目前，赤星病菌的檢測鑒定方法以形態(tài)學(xué)、生理學(xué)以及細(xì)胞學(xué)等為依據(jù)，主要以產(chǎn)孢表型、分生孢子等形態(tài)學(xué)指標(biāo)為主要依據(jù)，通過PCR技術(shù)，結(jié)合多基因位點(diǎn)序列進(jìn)行檢測。此外，馬貴龍等利用ELISA間接法成功對煙草種子上是否帶有赤星病菌進(jìn)行了鑒定，表明免疫學(xué)法可以用于快速檢測赤星病菌。

4? 結(jié)論與展望

目前，研究人員探索了一系列檢測煙草病毒的方法，電鏡檢測法更為直觀，可直接觀察到病毒的結(jié)構(gòu)和形態(tài);免疫學(xué)檢測法操作簡單，速度快;分子生物學(xué)法反應(yīng)靈敏、特異性強(qiáng);具體使用哪種方法需要根據(jù)檢測成本、檢測目的等因素而定。煙草青枯病常使用免疫學(xué)檢測法、分子生物學(xué)法進(jìn)行檢測鑒定。而煙草赤星病目前主要利用常規(guī)方法和基因測序相結(jié)合的方法。此外，免疫學(xué)檢測法也可用于煙草赤星病菌的檢測。隨著技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的現(xiàn)代分析測試技術(shù)將用于煙草病毒的檢測，為煙草病害的防治提供及時(shí)可靠的依據(jù)。

作者簡介：張朝（1987-），男，碩士，中級工程師。研究方向：煙草植保技術(shù)。