血清長鏈非編碼RNA MALAT1和AFAP1-AS1與鼻咽癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系

劉耿淳 申良方

鼻咽癌是一種在中國南方發(fā)病率較高的惡性腫瘤，被認(rèn)為是由愛潑斯坦-巴爾(EB)病毒感染和其他環(huán)境因素引起。早期治療鼻咽癌效果較好，5年生存率達(dá)85%[1-3]。然而，由于早期臨床癥狀不典型、不明顯，加上鼻咽癌病變較深且與顱底密切相關(guān)，鼻咽癌易遷移至顱底、咽旁區(qū)、頸動脈鞘等周圍組織，因此，探尋早期鼻咽癌診治分子標(biāo)志物具有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)被定義為長于200個核苷酸的非編碼RNA。lncRNA參與基因表達(dá)的多級調(diào)控，包括表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平。異常的lncRNA通過促進(jìn)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)驅(qū)動癌癥[4-5]。lncRNA在癌癥相關(guān)基因調(diào)控系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)紊亂可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。最近研究已證實(shí)lncRNA在血清或血漿中以可測量的水平存在，具有高穩(wěn)定性，使其成為有前景的生物標(biāo)志物[6]。血清循環(huán)RNA MALAT1可以區(qū)分肝癌患者和健康對照，并且AFAP1-AS1可以作為用于胃癌診斷和預(yù)后預(yù)測的新型血清生物標(biāo)志物。本研究擬探討血清lncRNA MALAT1和AFAP1-AS1與鼻咽癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為鼻咽癌的診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2013年4月—2015年6月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院第六臨床醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)的鼻咽癌患者136例為研究對象，符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(National Compre hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《NCCNCRC診治指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。鼻咽癌患者中男70例，女66例，年齡27～72歲，平均(55.45±5.63)歲。根據(jù)2008 TNM鼻咽癌分期系統(tǒng)，Ⅰ期25例，Ⅱ期32例，Ⅲ期48例，Ⅳa期20例，Ⅳb期11例。所有患者均通過組織病理學(xué)診斷確診，并進(jìn)行了明確的TNM分期。該研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署書面知情同意書。在涉及人類參與者的研究中進(jìn)行的所有程序均符合國家研究委員會的道德標(biāo)準(zhǔn)和赫爾辛基宣言中的道德標(biāo)準(zhǔn)。選擇我院2015年1月—5月的門診健康體檢者54例為對照組，其中男25例，女29例，年齡26～70歲，平均(55.87±5.14)歲。鼻咽癌組及對照組自愿提供血清，用于分析lncRNA MALAT1和AFAP1-AS1的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他腫瘤患者；參與者重要內(nèi)臟器官的功能障礙或失敗，包括肝臟、腎臟、心臟等；參與者在研究前進(jìn)行了放化療。

1.2 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表達(dá)水平的測定

使用TRIzol Reagent提取血清總RNA。使用SMA 400 UV-vis檢測分離的RNA的濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒從RNA樣品合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用標(biāo)準(zhǔn)SYBR Green PCR試劑盒方案和在CFX96實(shí)時(shí)上的TaqMan miRNA測定進(jìn)行l(wèi)ncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的實(shí)時(shí)PCR。lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表達(dá)結(jié)果通過內(nèi)參基因GAPDH均一化，并通過2-ΔΔCt方法計(jì)算。本試驗(yàn)中特異性引物如下：MALAT1上游序列5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，下游序列5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；AFAP1-AS1上游序列5′-CTAGTCTAGAGTCGCTGTTAT CTCATTGTCTG-3′，下游序列5′-CGCGGATCCT CTGCTTCTGTCACAGAATC-3′；GAPDH上游序列5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′，下游序列5′-TG TATCCAAACTCATTG TCATAC-3′。定量PCR的反應(yīng)條件如下：95℃10 min，45個循環(huán)，95℃20 s，60℃30 s，72℃20 s。PCR體系為：10 μL 2×QuantiTect SYBR Green RTPCR Master Mix、1.0 μL正向和反向引物(0.5 μm/L)、2 μg模板RNA、0.5 μLQuantiTectRT Mix和dd H2O。為分析lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1的表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床病理特征關(guān)系，定義2-ΔΔCt≤2為低表達(dá)，2-ΔΔCt>2為高表達(dá)[7]。

1.3 隨訪

隨訪開始日期為出院日期，隨訪結(jié)束日期為2018年12月31日，隨訪方式為門診及電話隨訪，隨訪內(nèi)容為患者出院后生存狀況，終點(diǎn)事件為死亡、隨訪時(shí)間截止及刪失，總生存期(OS)為出院至出現(xiàn)終點(diǎn)事件時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 對照組和鼻咽癌組中l(wèi)ncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平的表達(dá)

與對照組比較，鼻咽癌組lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達(dá)水平明顯升高(P<0.001)(表1)。

2.2 鼻咽癌患者lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達(dá)與年齡無關(guān)(P>0.05)；與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)(P<0.05)，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)的鼻咽癌患者lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表達(dá)率越高(表2)。

2.3 lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達(dá)水平與患者預(yù)后分析

lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達(dá)組2年生存率及總生存期均明顯高于lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表達(dá)組(P<0.001)(圖1，表3)。

表1 對照組和鼻咽癌組中l(wèi)ncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平的表達(dá)

表2 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達(dá)與鼻咽癌患者臨床病理特征的關(guān)系

表3 血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1蛋白表達(dá)水平與患者預(yù)后分析

圖1 lncRNA MALAT1/AFAP1-AS1高表達(dá)組與低表達(dá)組Kaplan-Meier生存曲線比較

2.4 預(yù)后多因素分析

將患者年齡、腫瘤直徑、病理學(xué)分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否等臨床特征及KPS評分和血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達(dá)等變量納入多因素Cox逐步回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡≥50歲(HR=1.92，95%CI：1.06～3.46)和病理級別Ⅲ～Ⅳ級(HR=3.70，95%CI：2.08～6.61)為鼻咽癌患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，lncRNA MALAT1低表達(dá)(HR=0.52，95%CI：0.37～0.81)和lncRNA AFAP1-AS1低表達(dá)(HR=0.56，95%CI：0.51～0.83)為鼻咽癌患者OS的獨(dú)立保護(hù)因素(P<0.001)(表4)。

表4 鼻咽癌患者OS多因素逐步Cox回歸分析結(jié)果(n=136)

3 討論

越來越多的證據(jù)表明，真核轉(zhuǎn)錄組和基因組不是蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄的簡單底物，lncRNA才是。lncRNA可能作為致癌基因或腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。已發(fā)現(xiàn)lncRNA的表達(dá)經(jīng)常在癌細(xì)胞中失調(diào)[8]。

lncRNA MALAT1基因長度為2.6 kb，由4個外顯子組成。lncRNA MALAT1成為編程分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗄芨杉?xì)胞的重要參與者。lncRNA MALAT1可促進(jìn)肝細(xì)胞癌、乳腺癌、乳腺干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展。lncRNA MALAT1通過阻止細(xì)胞應(yīng)激途徑(包括p53反應(yīng))的激活在調(diào)節(jié)乳腺癌中起關(guān)鍵作用[9-10]。lncRNA MALAT1是缺氧反應(yīng)性lncRNA，其通過miR-145參與肝細(xì)胞癌中缺氧信號傳導(dǎo)。惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與細(xì)胞的過度增殖密切相關(guān)[11-12]。由于癌細(xì)胞增殖過程中消耗大量氧氣，缺氧是腫瘤發(fā)展的常見原因。缺氧可使癌細(xì)胞改變其生物學(xué)行為以適應(yīng)缺氧環(huán)境，從而增加其侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能。在這種情況下，癌細(xì)胞生長所需的能量主要來自無氧糖酵解。因此，隨著癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的進(jìn)展，lncRNA MALAT1的表達(dá)繼續(xù)增加以滿足癌組織中葡萄糖代謝的需求。lncRNA MALAT1是跨膜葡萄糖輸入的重要細(xì)胞載體，并且是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)節(jié)因子；在正常組織或良性腫瘤中未檢測到lncRNA MALAT1表達(dá)，而在惡性腫瘤中通常發(fā)現(xiàn)高水平的lncRNA MALAT1，其機(jī)制是lncRNA MALAT1增加葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)[13-14]。因此，lncRNA MALAT1被認(rèn)為是細(xì)胞惡性腫瘤的早期標(biāo)志物之一。目前，大量研究表明lncRNA MALAT1在多種腫瘤中過表達(dá)，其表達(dá)水平與臨床分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

在大多數(shù)鼻咽癌患者中發(fā)現(xiàn)持續(xù)潛伏的EB病毒感染，表明其在鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展中的病因?qū)W作用。AFAP1-AS1是一種新鑒定的lncRNA。AFAP1-AS1的高表達(dá)與鼻咽癌患者的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)[15-16]。因此，AFAP1-AS1可能是鼻咽癌診斷生物標(biāo)志物和預(yù)后因素。研究發(fā)現(xiàn)EB病毒感染后NP69細(xì)胞中AFAP1-AS1的水平顯著增加。AFAP1-AS1最初被鑒定為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后標(biāo)志物，然后發(fā)現(xiàn)在一系列腫瘤類型中上調(diào)。AFAP1-AS1通過充當(dāng)miR-25的靶基因進(jìn)而促進(jìn)肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。體外細(xì)胞試驗(yàn)表明，AFAP1-AS1敲低抑制了NPC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、體外侵襲和增殖。進(jìn)一步的qRT-PCR檢測顯示AFAP1-AS1影響與轉(zhuǎn)移、侵襲和細(xì)胞周期相關(guān)的基因的表達(dá)。這說明AFAP1-AS1參與鼻咽癌進(jìn)展過程[17-18]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，鼻咽癌組lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達(dá)明顯升高；lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1表達(dá)與腫瘤最大徑、病理學(xué)分級、TNM分期、浸潤深度、淋巴血管間隙浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)，且腫瘤最大徑≥5 cm、病理學(xué)分期越高、TNM分期越高、浸潤深度越深、有淋巴血管間隙浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有復(fù)發(fā)，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表達(dá)率越高。這與上述討論癌組織中MALAT1、AFAP1-AS1高表達(dá)相符合，同時(shí)說明鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平升高，且與鼻咽癌惡性進(jìn)展有關(guān)。與此同時(shí)，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達(dá)組2年生存率及總生存期均明顯高于lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1高表達(dá)組；多因素Cox回歸分析顯示，lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達(dá)為鼻咽癌患者預(yù)后的保護(hù)因素，說明血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達(dá)的鼻咽癌患者預(yù)后良好。

本研究實(shí)驗(yàn)樣本偏少，且未探討MALAT1、AFAP1-AS1與鼻咽炎發(fā)病的分子機(jī)制聯(lián)系，這將在后續(xù)研究中完善。綜上所述，鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1水平升高，且與鼻咽癌惡性進(jìn)展有關(guān)；鼻咽癌患者血清lncRNA MALAT1、AFAP1-AS1低表達(dá)患者預(yù)后良好；MALAT1、AFAP1-AS1有望診斷鼻咽癌的新型標(biāo)志物。