當(dāng)歸成藥期次生代謝產(chǎn)物含量變化與早期抽薹相關(guān)性研究△

白貞芳，李萌，王杰，詹雪艷

北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488

中藥當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelicasisnensis(Oliv.)Diels的干燥的根，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功能，是常用的大宗藥材[1]。目前商品當(dāng)歸以栽培品為主，一般栽培當(dāng)歸兩年才能藥用，但部分栽培當(dāng)歸植株第二年就提前開花，這種現(xiàn)象叫早期抽薹；早期抽薹的當(dāng)歸根部無法進行正常的次生生長，沒有形成油室去產(chǎn)生大量的揮發(fā)油，根的柴性增強，從而喪失了其藥用價值。據(jù)了解，當(dāng)歸在道地產(chǎn)區(qū)甘肅岷縣正常年份的當(dāng)歸抽薹率為10%～30%，而嚴(yán)重時高達到80%以上，有時甚至全部早期抽薹。已有學(xué)者從當(dāng)歸種子質(zhì)量、育苗方式、種苗大小、移栽方式及外源激素等多方面進行了大量探索和實踐，但因防控技術(shù)難度大導(dǎo)致至今沒有根本性突破，早期抽薹仍是影響當(dāng)歸質(zhì)量和產(chǎn)量的重要因素[2-10]。

本研究采用高效液相色譜法和紫外分光光度法測定兩年生栽培當(dāng)歸不同生長時期根和地上部分阿魏酸和多糖含量[11-13]，探討了當(dāng)歸不同生長期、不同部位中阿魏酸與多糖的含量變化與當(dāng)歸早期抽薹的相關(guān)性，為深入研究當(dāng)歸早期抽薹機制提供實驗依據(jù)。

1 材料

島津LC-20AT高效液相色譜儀、UV檢測器、CTO-10AS柱溫箱、SIL-20A自動進樣器；BY45-YXS數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)；AL204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；WFJ2000紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)。

阿魏酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：20140301)；葡萄糖(上海源葉生物科技有限公司，批號：SA0418GA14)；纖維素酶(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：20131223)；甲醇、乙醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

實驗材料栽培在甘肅岷縣當(dāng)歸栽培基地，從2017年5月出現(xiàn)早薹苗時開始收集材料，每月收集1次，分別收集正常當(dāng)歸和早期抽薹當(dāng)歸的根及地上部分，陰干。共收集5批樣品，見表1。

表1 實驗材料

2 方法與結(jié)果

2.1 阿魏酸含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為XDS-C18柱，流動相為乙腈和0.085%磷酸水溶液比例為(17∶83)；測定波長：316 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取阿魏酸對照品6.28 mg置于50 mL容量瓶中，用70%的甲醇將阿魏酸溶解并定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為0.125 6 mg·mL-1的儲備液。分別精密吸取儲備液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL分別置于10 mL容量瓶中，并用70%甲醇將儲備液定容至10 mL，在進樣前用0.45 μm濾膜過濾，進樣量為10 μL，檢測，得阿魏酸線性回歸方程，保留時間為15.458 min。依據(jù)HPLC的峰面積(Y)和阿魏酸質(zhì)量濃度(X)進行回歸分析，得方程Y=43 178X-2 682.7，r=0.999 5，表明當(dāng)阿魏酸在1.256～20.096 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系(圖1)。

注：A.正常當(dāng)歸根部提取物；B.正常當(dāng)歸葉提取物；C.阿魏酸對照品。圖1 當(dāng)歸及阿魏酸對照品HPLC圖

2.1.3 供試品溶液制備 取0.2 g當(dāng)歸粉末(過60目篩)，精密稱定后置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，稱質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱質(zhì)量。減失質(zhì)量用70%甲醇補足，0.45 μm濾膜濾過，取濾液供阿魏酸測定。

2.1.4 精密度試驗 準(zhǔn)確取阿魏酸對照品溶液10 μL，迸樣5次，得阿魏酸相對保留時間的RSD為0.17%，計算阿魏酸峰面積的RSD為0.28%，表明精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗 準(zhǔn)確稱取當(dāng)歸0.2 g，同時制備供試液5份，以10 μL進樣，記錄各色譜圖，測定峰面積，計算阿魏酸含量，RSD為2.26%，表明重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 準(zhǔn)確稱取當(dāng)歸0.2 g制備供試液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h進樣10 μL。記錄各色譜圖，測定其峰面積，對照品在不同時間點峰面積的RSD為 0.31%，含量的RSD為0.31%，結(jié)果表明供試品溶液中阿魏酸在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 回收率試驗 準(zhǔn)確稱取實驗樣品0.2 g 5份，分別加入阿魏酸對照品82.43 μg，按樣品測定方法提取和測定。得回收率為101.46%(n=5)，RSD為0.98%(見表2)。

表2 當(dāng)歸中阿魏酸加樣的回收率(n=5)

2.1.8 含量測定 準(zhǔn)確稱取待測各實驗樣品0.2 g，每個實驗樣品同時制備供試液2份，在上述已建立的HPLC條件下檢測，外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中阿魏酸含量，兩次實驗數(shù)據(jù)的平均值作為每個實驗樣品中阿魏酸含量，各批次樣品中阿魏酸含量的變化見圖2～3。

圖2 正常根和抽薹根中阿魏酸含量趨勢

2.2 多糖含量測定方法的建立

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 將精密稱取的8.87 mg葡萄糖對照品溶解在50 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容，得儲備液(質(zhì)量濃度為0.177 4 mg·mL-1)。分別精密吸取儲備液 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL定容于2 mL容量瓶中，即得葡萄糖對照液(質(zhì)量濃度分別為0.035 48、0.053 22、0.070 96、0.088 70、0.106 64 mg·mL-1)。分別吸取1 mL上述標(biāo)準(zhǔn)液，置于1～5號具塞試管中，加2.0mL的5%苯酚溶液，搖勻，再加7.0 mL濃硫酸混勻，沸水浴加熱20 min，室溫冷卻。蒸餾水空白對照。測定不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液在490 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程Y=0.068 1X-0.016 8，r=0.999 6，說明質(zhì)量濃度3.548～10.664 μg·mL-1葡萄糖與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取 2.0 g 當(dāng)歸粉末(過40目篩)以及6.40 mg纖維素酶于 5 只 50 mL 錐形瓶中，各加 8 倍量的蒸餾水，將溶液 pH 值調(diào)至 5.0，60 ℃浸泡提取 4 h，再置于 100 ℃水浴 10 min 將酶滅活，放置至室溫。抽濾后，濾液中加入1/5 體積的Sevage 試劑，混合振蕩后除去有機層，重復(fù)6～7次，當(dāng)水相和有機相之間不再出現(xiàn)白色沉淀后，將水相移至50 mL容量瓶中定容備用。

2.2.3 精密度試驗 準(zhǔn)確量取葡萄糖對照品溶液1.0 mL，稀釋至2.0 mL，顯色后測量吸光度，重復(fù)5次，得RSD為0.17%。表明該對照品精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 稱取當(dāng)歸各2.0 g，制備供試液5份，稀釋150倍，精密量取供試品溶液1.0 mL，測定吸光度。記錄吸光度，以葡萄糖來計算供試品中多糖的含量，RSD為0.97%，表明重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密稱取當(dāng)歸2.0 g制備供試液，準(zhǔn)確量取供試品溶液1.0 mL，分別于顯色后0、12、24、48、72 h，測定吸光度，計算其含量RSD為1.46%。說明供試品顯色后72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 回收率試驗 準(zhǔn)確稱取實驗樣品1.0 g和葡萄糖0.3 g，制得供試液5份，測定吸光度，得回收率98.68%(n=5)，RSD為4.34%(見表3)。

表3 當(dāng)歸中葡萄糖的回收率(n=5)

2.2.7含量測定 分別取實驗樣品，按照上述方法測定吸光度，利用葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算多糖含量，不同批次的樣品中多糖的含量以葡萄糖來計，結(jié)果見圖4～5。

圖4 正常根及抽薹根中多糖含量變化趨勢

圖5 正常葉及抽薹葉中多糖含量變化趨勢

3 結(jié)論與討論

當(dāng)歸不同生長時期根和地上部分中阿魏酸的含量存在顯著差異。正常當(dāng)歸根中阿魏酸的含量，5月份含量較高，隨著時間推移，其含量逐漸遞減，8月份時，阿魏酸含量最低，9月底到10月初含量突然急劇增高。正常當(dāng)歸葉中阿魏酸含量變化趨勢相反，先增加后減少，6—7月份含量最高，9月底采收的當(dāng)歸葉中阿魏酸含量無法測到。通常，阿魏酸含量隨遮陽率的升高而增加[5]，而9月份正是當(dāng)歸采收期，正值日照漸短之際，相當(dāng)于遮陽率升高，阿魏酸向根部積累，這可能是9月30號采收的這批樣品，正常根阿魏酸含量出現(xiàn)反向增長的原因。抽薹當(dāng)歸根中阿魏酸含量，隨著生長周期的推移其含量漸漸減小，5月份剛剛抽薹時，阿魏酸含量較高，到6月底這段時間，根中阿魏酸含量急劇下降；從6月底—9月底，低水平的阿魏酸含量基本保持不變(圖2)，抽薹當(dāng)歸葉中阿魏酸含量在整個生長周期中基本保持在較低的水平(圖3)。這可能是由于6月份植株體內(nèi)大量的營養(yǎng)成分用于抽薹，當(dāng)歸根部得不到充足的營養(yǎng)而無法進行正常代謝活動，導(dǎo)致根部柴性增強，有效成分阿魏酸也不能繼續(xù)積累，故抽薹后當(dāng)歸根部阿魏酸含量保持低水平的不變。

正常當(dāng)歸與抽薹當(dāng)歸不同部位阿魏酸含量有一定差異。5—8月，兩者根部阿魏酸含量相當(dāng)，9月底，正常當(dāng)歸根部阿魏酸含量顯著高于抽薹當(dāng)歸(圖2)。通常當(dāng)歸在 6—7月份進入抽薹期[5]，此時正常當(dāng)歸葉中阿魏酸含量高于抽薹當(dāng)歸，8月底兩種當(dāng)歸已完成開花，8—9月底兩者葉中阿魏酸含量均處于較低水平，不存在顯著差異(圖3)。當(dāng)歸開完花后，抽薹當(dāng)歸的根部處于木質(zhì)化狀態(tài)，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物阿魏酸能力很低，而開完花后正常當(dāng)歸仍具有正常的生理活性，代謝產(chǎn)物阿魏酸在其根部積累增長，故9月份抽薹當(dāng)歸根部阿魏酸含量仍處于較低水平，正常當(dāng)歸根部阿魏酸含量顯著高于抽薹當(dāng)歸。

正常當(dāng)歸根中多糖含量9月份之前變化幅度不大，而9月份這一個月內(nèi)多糖含量急劇增加。說明9月份根是生長中心，光合作用產(chǎn)生的大量營養(yǎng)物質(zhì)涌向根部并積累，確保了根的正常發(fā)育和代謝產(chǎn)物的積累。抽薹當(dāng)歸根中的多糖含量都隨時間推移基本呈趨于穩(wěn)定(圖4)。這可能是當(dāng)歸開始抽薹后，生長中心是地上部分，植物光合作用產(chǎn)生的大部分營養(yǎng)物質(zhì)積聚在地上部分，加快了當(dāng)歸生長發(fā)育的進程，出現(xiàn)了早期抽薹現(xiàn)象，此時抽薹當(dāng)歸根部處于木質(zhì)化中，無法產(chǎn)生充足的代謝產(chǎn)物(如多糖)，故抽薹當(dāng)歸根中多糖含量隨時間推移變化不大。

正常當(dāng)歸葉中多糖含量在5—9月份隨時間推移而緩慢降低，說明在成藥期，葉片產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)主要供給當(dāng)歸其他部位的生長發(fā)育，可能前期供給當(dāng)歸開花，花期完成后供給根部，導(dǎo)致根部多糖含量9月份出現(xiàn)增長。抽薹當(dāng)歸葉中多糖含量隨時間推移呈現(xiàn)先減后增的趨勢，5月底到8月底，多糖含量緩慢降低，到9月底，多糖含量又突然增高(圖5)。這可能是因為當(dāng)歸開始抽薹時，大部分營養(yǎng)物質(zhì)用于開花，故7、8月份抽薹葉多糖含量很低。而9月份當(dāng)歸已完成開花過程，不需要太多的營養(yǎng)物質(zhì)，但由于抽薹當(dāng)歸此時根部已經(jīng)木質(zhì)化，光合作用產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)貯存在葉片中，故這時抽薹當(dāng)歸葉中多糖含量出現(xiàn)增加現(xiàn)象。

正常當(dāng)歸與抽薹當(dāng)歸根部和葉中多糖的含量存在顯著差異。正常當(dāng)歸根部的多糖含量顯著高于抽薹當(dāng)歸(圖4)，而在5—8月份兩者葉中多糖含量相當(dāng)，9月份抽薹當(dāng)歸葉中多糖含量出現(xiàn)急劇增加，顯著高于正常當(dāng)歸葉中的含量(圖5)。兩種當(dāng)歸在9月已完成開花，此時抽薹當(dāng)歸根部處于木質(zhì)化狀態(tài)，營養(yǎng)物質(zhì)主要在葉中貯藏，故抽薹當(dāng)歸葉中多糖含量顯著升高，而正常當(dāng)歸此時營養(yǎng)物質(zhì)主要在根部積累，因此正常當(dāng)歸葉中多糖含量仍處于一個較低穩(wěn)定水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于抽薹當(dāng)歸葉片中多糖的含量，而抽薹當(dāng)歸葉片中多糖含量出現(xiàn)增長的現(xiàn)象。

栽培當(dāng)歸的早期抽薹嚴(yán)重影響次生代謝產(chǎn)物積累，對當(dāng)歸藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量都有很大程度的制約，阻礙了當(dāng)歸資源的可持續(xù)發(fā)展。前人研究發(fā)現(xiàn)，通過篩選種子和種苗、控制育苗時間、改動栽培方式等措施可不同程度降低當(dāng)歸早期抽薹率。雖然研究取得了一定的成果，但目前早期抽薹仍是當(dāng)歸生產(chǎn)和發(fā)展的主要制約因素。本項目初步探討了栽培當(dāng)歸在第二年生長過程中阿魏酸和多糖含量與早期抽薹的之間的關(guān)系，要準(zhǔn)確了解當(dāng)歸生長過程中次生代謝產(chǎn)物與抽薹的關(guān)聯(lián)性，還需要重復(fù)驗證，這也是本項目后續(xù)研究的內(nèi)容之一。