分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用△

王剛，曹佩，韋學(xué)敏，韓建萍

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193

DNA分子標(biāo)記(DNA molecular markers)技術(shù)通過分析生物體間具有遺傳信息差異的DNA片段，進(jìn)而揭示生物內(nèi)在基因的排布規(guī)律及其表型性狀的表現(xiàn)規(guī)律。該技術(shù)具有速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，且不受生物體生長(zhǎng)發(fā)育階段、供試部位、試驗(yàn)條件等因素的影響，已廣泛應(yīng)用于生物體的基因組研究、遺傳育種、起源進(jìn)化、分類鑒定等多個(gè)領(lǐng)域。將DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源的研究，可在藥用植物分類及親緣關(guān)系鑒定、道地性研究、生物多樣性保護(hù)及推進(jìn)中藥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)代化等各方面展示其廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。目前常用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat，SSR)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(Sequence-related Amplified Polymorphism，SRAP)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(Inter-simple Sequence Repeat，ISSR)、DNA條形碼等[4-6]。

1 分子標(biāo)記種類及優(yōu)缺點(diǎn)

近些年來，分子標(biāo)記技術(shù)迅速發(fā)展，目前已開發(fā)出幾十種分子標(biāo)記，并在各個(gè)領(lǐng)域得到了應(yīng)用。廣義的分子標(biāo)記包括可遺傳的DNA序列和蛋白質(zhì)，狹義的分子標(biāo)記只是指DNA標(biāo)記。和以往的遺傳標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有以下優(yōu)越性：1)不易受外界條件限制，在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段、各個(gè)組織中均可檢測(cè)到，不受基因表達(dá)與否的影響；2)標(biāo)記位點(diǎn)遍布整個(gè)基因組，且數(shù)量眾多；3)變異在自然條件下即存在，無需創(chuàng)造特殊的遺傳研究材料；4)不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無必然連鎖；5)有許多分子標(biāo)記能夠提供較為完整的遺傳信息，可區(qū)分植物個(gè)體的純/雜合基因型。

DNA分子標(biāo)記的這些特點(diǎn)使其得到了廣泛的應(yīng)用，如種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建及數(shù)量性狀基因定位(QTL)、目標(biāo)性狀基因的標(biāo)記與定位(包括質(zhì)量性狀和數(shù)量性狀)、作物品種純度鑒定以及品質(zhì)和抗性育種等。目前，廣泛用于各方面研究的分子標(biāo)記主要有RAPD、SSR、AFLP、DNA條形碼等[7-9]。

1.1 RFLP

RFLP是由Botsein等[11]提出的應(yīng)用最早的分子標(biāo)記。該標(biāo)記已被應(yīng)用于藥用植物鑒定、親緣關(guān)系分析、群體遺傳多樣性測(cè)定以及構(gòu)建基因連鎖圖譜等方面。但RFLP技術(shù)操作復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，限制性內(nèi)切酶的選用要求嚴(yán)格，且涉及到放射性物質(zhì)的使用，可能對(duì)操作人員身體健康產(chǎn)生不利影響，這在一定程度上影響了該技術(shù)的應(yīng)用[10-11]。

王雪松等[12]通過建立PCR-RFLP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)指紋圖譜的方法鑒定西洋參和人參，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶切后的西洋參顯示出80 bp和42 bp的兩條基因片段，而人參只顯示122 bp的單一片段，通過此方法可快速有效鑒定出人參和西洋參。趙仲麟等[13]利用RFLP標(biāo)記對(duì)川貝母真?zhèn)涡赃M(jìn)行相對(duì)定量分析研究，結(jié)果表明含量超過10%的真品川貝母都能被穩(wěn)定檢測(cè)出來，且通過優(yōu)化后的方法能相對(duì)定量地檢測(cè)出摻假量。杜明鳳等[14]利用RFLP標(biāo)記分析研究淫羊藿屬植物的遺傳多樣性，表明淫羊藿屬植物的細(xì)胞質(zhì)基因組之間存在微弱遺傳差異，且其遺傳關(guān)系與地理分布關(guān)系密切。張瓊瓊等[15]基于末端限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)對(duì)不同水位梯度植物的根際細(xì)菌群落多樣性特征進(jìn)行分析，研究結(jié)果顯示，隨著水位梯度的加深，植物根際細(xì)菌群落多樣性呈減少趨勢(shì)，不同生態(tài)型植物根際泌氧能力降低，進(jìn)而抑制根際好氧細(xì)菌的生存。

1.2 RAPD

RAPD是基于PCR技術(shù)建立的檢測(cè)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA的技術(shù)。RAPD因技術(shù)簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏而廣泛應(yīng)用于藥用植物的研究中。魏曉雨等[16]通過RAPD和ISSR標(biāo)記技術(shù)分析不同產(chǎn)地西洋參的種質(zhì)資源，兩種標(biāo)記方法得到的結(jié)果存在微小差異，但總體趨勢(shì)一致；研究發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)環(huán)境及種植條件的影響下，東北部分產(chǎn)地西洋參與加拿大西洋參在遺傳多樣性上有所差異。徐雯等[17]基于RAPD研究分析福建產(chǎn)南方紅豆杉遺傳多樣性，結(jié)果顯示不同種源間的南方紅豆杉存在一定的遺傳變異，但不同種群間的南方紅豆杉群體相似度較高，親緣關(guān)系較近。馬艷芝等[18]對(duì)來自不同產(chǎn)區(qū)的11份荊芥種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)供試荊芥種質(zhì)資源遺傳差異不大，遺傳基礎(chǔ)較窄，遺傳多樣性不高；進(jìn)一步分析出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是荊芥種質(zhì)資源不同地域引種混亂，品種混雜，缺乏一定的規(guī)范與標(biāo)準(zhǔn)。劉雙利等[19]利用RAPD-PCR標(biāo)記分析探討不同品種莪術(shù)的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)莪術(shù)群體中存在較豐富的遺傳多樣性，具有明顯的遺傳分化，這些遺傳分化為莪術(shù)的種質(zhì)資源篩選，高效育種和生物技術(shù)開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1.3 SSR

SSR又稱微衛(wèi)星(microsatelliet)，是一段簡(jiǎn)單的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛分布于動(dòng)植物基因組中。通過率先獲取SSR的側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)SSR引物，進(jìn)一步分析找到序列中的特異保守區(qū)。當(dāng)目標(biāo)物種缺乏前期研究工作，無法直接得到SSR分子標(biāo)記時(shí)，則需要對(duì)該物種進(jìn)行分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)開發(fā)[20-21]。

朱巧等[22]對(duì)黃精屬6種植物進(jìn)行SSR遺傳差異分析，在對(duì)60份種質(zhì)資源材料進(jìn)行遺傳差異性和群體結(jié)構(gòu)分析后，發(fā)現(xiàn)黃精屬植物遺傳多樣性豐富，變異幅度大，種的界限相對(duì)模糊，互生葉系與輪生葉系的某些植物存在差異減小的現(xiàn)象；西部地區(qū)的植物遺傳多樣性高于其他地區(qū)，推測(cè)其可能是我國(guó)黃精屬植物的起源中心。楊妮等[23]利用SSR分子標(biāo)記分析廣西莪術(shù)種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果顯示50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料間具有較高的遺傳多樣性，不同產(chǎn)地莪術(shù)的遺傳相似系數(shù)差別較大，說明不同地區(qū)的莪術(shù)居群之間遺傳分化明顯；進(jìn)一步將SSR擴(kuò)增條帶統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)聚類分析后，對(duì)50份廣西莪術(shù)種質(zhì)材料進(jìn)行分類，并初步確定不同材料間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。李春花等[24]利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建云南苦蕎種質(zhì)資源分子身份證，為云南苦蕎的種質(zhì)資源鑒定和保護(hù)提供依據(jù)。此外，目前已利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)薄荷、百合、菊花、丹參、牡丹、黃柏等藥用植物的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了分析研究[25-30]。

1.4 SNP

SNP標(biāo)記被稱作第三代DNA遺傳標(biāo)記，該標(biāo)記可識(shí)別單個(gè)核苷酸，通過DNA序列間的細(xì)微差異區(qū)分不同個(gè)體，較之SSR多態(tài)性更高，可獲得更加精確的DNA片段序列信息，對(duì)DNA嚴(yán)重降解的供試材料也同樣適用。DNA芯片技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)SNP位點(diǎn)，該技術(shù)可基于已表達(dá)的基因，將與植物表型性狀相關(guān)的基因與環(huán)境變化相聯(lián)系，用于藥用植物的道地性評(píng)價(jià)及道地性機(jī)制的研究[31-32]。

王景等[33]利用SNP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定人參品種大馬牙，根據(jù)大馬牙的特異SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物，并建立鑒定大馬牙的多重PCR體系。結(jié)果顯示，在多重PCR體系中，只有大馬牙產(chǎn)生了410 bp的特異性條帶，實(shí)現(xiàn)大馬牙快速有效鑒定。王麗麗等[34]基于SNP位點(diǎn)對(duì)藏菖蒲及其近緣種進(jìn)行鑒定，通過對(duì)藏菖蒲同屬近緣種的96條ITS2序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)第23位和212位存在穩(wěn)定的SNP位點(diǎn)，可準(zhǔn)確鑒定藏菖蒲；同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)藏菖蒲ITS2序列的種內(nèi)變異很小，僅在158位存在一個(gè)多拷貝位點(diǎn)。趙俊生等[35]利用高分辨率熔解曲線對(duì)21份化橘紅及3份近緣種質(zhì)蜜柚和黃皮的25個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型，結(jié)果將全部的24份樣本分為3類，化橘紅種質(zhì)單獨(dú)聚為一類，表明SNP分子標(biāo)記可有效對(duì)化橘紅種質(zhì)進(jìn)行資源評(píng)價(jià)及品種鑒定。Li等[36]通過SNP標(biāo)記對(duì)枇杷的品種多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)，新發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)為枇杷的品種鑒定、遺傳多樣性分析和優(yōu)質(zhì)育種提供了有力的分子研究工具。

1.5 AFLP

AFLP標(biāo)記技術(shù)具有分辨率高、重復(fù)性好和靈敏度高等特點(diǎn)，可準(zhǔn)確有效地分析種以下水平的變異，在群體結(jié)構(gòu)調(diào)查和亞種分化的研究中發(fā)揮重要作用[37]。因此被廣泛地應(yīng)用于遺傳結(jié)構(gòu)和地理位置關(guān)系的研究、遺傳多樣性的計(jì)算、物種起源的確定以及研究屬間各種之間的關(guān)系[38-40]。

楊春勇等[41]利用AFLP和ISSR分析栽培沉香的遺傳多樣性，結(jié)果表明2種標(biāo)記技術(shù)均能應(yīng)用于沉香屬植物的遺傳多樣性研究，2種標(biāo)記的分析結(jié)果均表現(xiàn)出沉香屬植物具有較高的遺傳多樣性水平；AFLP標(biāo)記具有較高的多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)效率，其標(biāo)記分析的遺傳多樣性參數(shù)高于ISSR。宋爽等[42]利用這2種分子標(biāo)記分析石斛種質(zhì)資源的遺傳多樣性，表明ISSR和AFLP標(biāo)記技術(shù)都能有效地區(qū)分不同材料，且初步反映它們之間的親緣關(guān)系；兩種標(biāo)記技術(shù)對(duì)石斛群體種系間關(guān)系與變異的分析結(jié)果基本一致，發(fā)現(xiàn)石斛群體內(nèi)的分化較小，群體間的分化較大，群體間的基因流動(dòng)較小。張錚等[43]利用AFLP標(biāo)記研究三葉木通種質(zhì)資源的遺傳多樣性，通過對(duì)陜西秦嶺地區(qū)6個(gè)天然居群的111份三葉木通種質(zhì)的分析，發(fā)現(xiàn)陜西秦嶺地區(qū)三葉木通天然居群的遺傳多樣性水平較低，居群內(nèi)與居群間的遺傳變異程度基本相同。

1.6 ISSR

ISSR標(biāo)記技術(shù)根據(jù)植物廣泛存在SSR的特點(diǎn)，利用植物基因組本身的SSR設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增重復(fù)序列之間的區(qū)域，無需預(yù)先對(duì)目標(biāo)材料進(jìn)行克隆和測(cè)序，但反應(yīng)條件和實(shí)驗(yàn)結(jié)果易受各種因素的干擾，各反應(yīng)參數(shù)都必須事先優(yōu)化選擇[44-45]。

趙孟良等[46]利用ISSR對(duì)來自國(guó)內(nèi)外的43份菊芋種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明國(guó)內(nèi)外菊芋資源間遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，國(guó)外資源存在豐富的遺傳多樣性，ISSR能準(zhǔn)確區(qū)分菊芋資源的國(guó)內(nèi)外品種。Wang等[47]通過研究不同保存方法對(duì)植物樣品ISSR和RAPD分子標(biāo)記的影響，發(fā)現(xiàn)不同的保存方法對(duì)分子標(biāo)記的分析結(jié)果影響較大，而保存時(shí)間對(duì)其影響較小，為根據(jù)研究對(duì)象選擇合適的保存方法提供參考。Yu等[48]利用ISSR技術(shù)研究瀕危藥用植物厚樸的遺傳多樣性及親緣關(guān)系，進(jìn)一步分析厚樸種群變化、遺傳進(jìn)化及地理隔離之間的聯(lián)系。

1.7 DNA條形碼

DNA條形碼(DNA barcoding)是通過利用一段短的、標(biāo)準(zhǔn)的DNA序列進(jìn)行物種鑒定的分子技術(shù)。通過提取得到供試材料較為完整的DNA，利用通用引物擴(kuò)增短的條形碼序列，分析不同物種在該序列區(qū)域存在的差異，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥用植物的快速準(zhǔn)確鑒定。條形碼技術(shù)操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確高效，得到的研究結(jié)果在不同物種之間具有可比性，推動(dòng)了分子水平上物種鑒定與進(jìn)化研究的快速發(fā)展。利用相對(duì)較短的基因保守序列進(jìn)行物種鑒定，使分子標(biāo)記技術(shù)可以得到更廣泛的應(yīng)用，不再受傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法需依賴長(zhǎng)期經(jīng)驗(yàn)的局限。通過建立可視化的DNA條形碼信息數(shù)據(jù)庫，制定標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)操作流程，可使物種鑒定更加規(guī)范科學(xué)。研究人員短時(shí)間即可掌握，易于該技術(shù)的推廣。這將對(duì)推動(dòng)傳統(tǒng)醫(yī)藥走向國(guó)際化發(fā)揮重要作用，是藥用植物分子鑒定方法學(xué)上的一個(gè)巨大創(chuàng)新[49]。

陳士林等[50-52]在大樣本量的實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，創(chuàng)建了以ITS2序列為主要條形碼的中藥材DNA條形碼分子鑒定體系，提出以ITS2為主，psbA-trnH為輔的植物類中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則。廖保生等[53]通過開發(fā)一段三七分子身份證序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)三七藥材、粉末的快速鑒定；韓建萍等[54]利用ITS2序列有效鑒定筋骨草及其近緣種、辛天怡等[55]利用ITS2區(qū)分當(dāng)歸、羌活等藥材及其混淆品；此外，已通過DNA條形碼技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)對(duì)人參、丹參、蓼科等藥用植物的快速鑒定[56-59]。為克服樣品DNA降解不易進(jìn)行PCR擴(kuò)增的問題，Meusnier等[60]提出了“mini barcode”的概念，通過開發(fā)通用條形碼序列中的部分短序列對(duì)目標(biāo)物種及其近緣種進(jìn)行鑒定。相關(guān)研究[61-65]在“mini barcode”的基礎(chǔ)上提出“分子身份證”的概念，利用一段長(zhǎng)為20～50 bp物種特異的分子標(biāo)記，對(duì)目標(biāo)物種進(jìn)行鑒定，該方法已被用于人參、西洋參、杜仲、當(dāng)歸、銀杏等物種的鑒定?！胺肿由矸葑C”方法操作簡(jiǎn)便，適用于對(duì)DNA已降解的復(fù)雜樣本的檢測(cè)。

除上述幾種常用的分子標(biāo)記外，其他的一些分子標(biāo)記技術(shù)包括SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)、STS(Sequence-Tagged Site)、SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism)、CAPS(Cleaved Amplified Polymorphism Sequence-Tagged Site)等也已在藥用植物資源的各方面研究中得到了應(yīng)用。此外，β-AS基因和高通量分型競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(KASP)標(biāo)記技術(shù)也被用于藥用植物的多樣性研究、譜系地理學(xué)以及抗病性狀相關(guān)的基因檢測(cè)[66-68]。

分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，促進(jìn)了眾多分子標(biāo)記技術(shù)的產(chǎn)生并廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。分子標(biāo)記間各有優(yōu)勢(shì)與不足，不同的標(biāo)記技術(shù)相互結(jié)合后，又可產(chǎn)生新的標(biāo)記技術(shù)。當(dāng)前已有幾十種分子標(biāo)記，且各有其特點(diǎn)，根據(jù)不同的研究對(duì)象、目的及研究深度，研究者可進(jìn)行合理選擇。

2 藥用植物種質(zhì)資源研究現(xiàn)狀

藥用植物種質(zhì)資源是保障藥用植物可持續(xù)發(fā)展，進(jìn)一步開發(fā)傳統(tǒng)藥物的根本，同時(shí)也是傳統(tǒng)中醫(yī)藥發(fā)展的基礎(chǔ)。當(dāng)前藥用植物已不僅僅局限于醫(yī)藥使用，而是廣泛應(yīng)用于保健、食用、化妝品、綠色農(nóng)藥等各個(gè)方面[69]。隨著對(duì)藥用植物資源的多元化開發(fā)利用，其社會(huì)需求在迅速增長(zhǎng)，也由此導(dǎo)致了藥用植物的過度損耗，生物多樣性減少，野生資源嚴(yán)重萎縮，一些珍稀藥用植物已經(jīng)滅絕或?yàn)l臨滅絕。因此，作為我國(guó)重要的生物資源，藥用植物種質(zhì)資源的收集、整理及專業(yè)保護(hù)變得尤為重要[70-72]。

表1 不同分子標(biāo)記之間的比較

藥用植物的生境千差萬別，形態(tài)鑒別存在較大的不確定性，而采用分子標(biāo)記技術(shù)能實(shí)現(xiàn)對(duì)植物品種快速準(zhǔn)確地鑒定。除DNA分子標(biāo)記外，等位酶技術(shù)也已被運(yùn)用于藥用植物資源遺傳多樣性的檢測(cè)。但酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，而基因表達(dá)的不確定性及時(shí)空特異性，導(dǎo)致酶不可能在同一生物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段一直存在。另外，由于條件限制，能檢測(cè)到的等位酶位點(diǎn)數(shù)量有限，而根據(jù)有限位點(diǎn)所得出的遺傳多樣性，不一定能代表整個(gè)基因組的實(shí)際情況。

目前藥用植物種質(zhì)資源研究的內(nèi)容主要包括資源調(diào)查與珍稀瀕危藥用植物的保護(hù)、藥用植物的道地性研究、藥用植物的遺傳多樣性及分類學(xué)研究、優(yōu)良品種的培育、種質(zhì)資源保存技術(shù)等。因生長(zhǎng)環(huán)境、栽培方式、采收時(shí)期與方法、藥用部位、繁殖方式、播種時(shí)期等多方面因素都會(huì)對(duì)藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生影響，故對(duì)藥用植物種質(zhì)資源的研究又存在一定的特殊性。因此，為保證藥用植物資源的可持續(xù)利用，需進(jìn)一步建立完善的藥用植物種質(zhì)資源保存體系，加大研究力度，培育優(yōu)良品種，建立規(guī)范化種植基地，綜合利用藥用植物資源[73-76]。

3 分子標(biāo)記在藥用植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用及前景分析

3.1 分子標(biāo)記在藥用植物種質(zhì)鑒定與道地性研究中的應(yīng)用

種質(zhì)鑒定除用來在資源群體中找出真實(shí)優(yōu)質(zhì)的種質(zhì)材料，還可以在藥用植物資源的保存管理過程中，去偽存真，發(fā)現(xiàn)并剔除重復(fù)樣品，提高保存效率。傳統(tǒng)的鑒定方法建立在植物表型特征的基礎(chǔ)上，以形態(tài)及顯微性狀觀測(cè)和化學(xué)成分分析為主要研究手段。然而，對(duì)一些易混淆種、疑難種及近緣種的鑒定，傳統(tǒng)方法往往較難得出準(zhǔn)確的結(jié)論，且對(duì)鑒定工作者專業(yè)水平要求較高。而分子標(biāo)記技術(shù)通過直接分析藥用植物的遺傳信息，從本質(zhì)上反應(yīng)各個(gè)體或群體間的差異，實(shí)現(xiàn)物種間的快速鑒別。此外，利用分子標(biāo)記對(duì)名優(yōu)道地藥材的遺傳信息進(jìn)行比較分析，可進(jìn)一步找到劃分藥用植物種質(zhì)檔次的分子標(biāo)記，以促進(jìn)藥用植物的道地性研究[77-78]。

王丹丹等[79]采用表達(dá)序列標(biāo)簽微衛(wèi)星標(biāo)記(EST-SSR)技術(shù)對(duì)126個(gè)東北紅豆杉雜交樣本及其親本基因組DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，分析了雜交種與其父、母本間擴(kuò)增譜帶的多態(tài)性，建立了雜交種快速鑒定體系；王嵐等[80]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)來自國(guó)內(nèi)17個(gè)居群的285個(gè)川芎個(gè)體進(jìn)行道地性分析，結(jié)果顯示采自四川省內(nèi)的10個(gè)川芎居群表現(xiàn)出更近的親緣關(guān)系，各個(gè)川芎居群間具有較高的遺傳多樣性；此外，曹亮等[81]通過建立吳茱萸的RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)吳茱萸的道地性遺傳背景進(jìn)行分析探討，發(fā)現(xiàn)不同品種吳茱萸之間遺傳差異較大。

SSR、RAPD、DNA條形碼等分子標(biāo)記技術(shù)為中藥資源的種質(zhì)鑒定提供了一個(gè)新思路，且操作簡(jiǎn)單，不易受外界因素影響。分子水平的鑒定分析是一種快速有效的藥用植物鑒定方法，當(dāng)前已被廣泛應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源鑒定及道地性研究中。此外，分子標(biāo)記為藥用植物道地性研究提供了新思路、新方法，進(jìn)一步促進(jìn)中藥材道地性的機(jī)理研究。

3.2 分子標(biāo)記在鑒定藥用植物親緣關(guān)系及遺傳多樣性中的應(yīng)用

分子標(biāo)記通過直接分析植物群體的DNA遺傳信息，能夠從本質(zhì)上反映藥用植物間的親緣關(guān)系，為藥用植物分類提供更加方便可靠的技術(shù)手段。此外，通過對(duì)藥用植物的遺傳信息進(jìn)行分析比較，并建立可視化的信息數(shù)據(jù)庫，繪制系統(tǒng)發(fā)育框圖，可使藥用植物資源的分類及其他相關(guān)研究更加科學(xué)規(guī)范[82]。受自然選擇、遷移、突變等多種因素的影響，天然群體的基因頻率會(huì)在一定的水平上波動(dòng)，并直接反映在DNA水平上[83]。因此，利用DNA分子標(biāo)記研究藥用植物的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，可以有效地揭示種群間及種群內(nèi)的遺傳多樣性，進(jìn)而分析其系統(tǒng)分化規(guī)律，了解基因流動(dòng)趨勢(shì)，為制定基因保存時(shí)的取樣策略，進(jìn)行種源區(qū)劃以及鑒定具有生產(chǎn)力最佳搭配的雜交群體提供參考；同時(shí)，可促進(jìn)對(duì)藥用植物種質(zhì)資源進(jìn)化過程的進(jìn)一步了解，指導(dǎo)開展藥用植物的遺傳育種及引種馴化[84-86]。

3.3 分子標(biāo)記在藥用植物資源與生物多樣性保護(hù)中的應(yīng)用

藥用植物生物多樣性的研究包括對(duì)生態(tài)系統(tǒng)、群體種類和遺傳結(jié)構(gòu)等不同水平上的多樣性研究。其中，遺傳多樣性的研究是生物多樣性研究的中心環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究手段已不足以區(qū)分在不同水平下存在的多樣性差異；而分子生物學(xué)的方法則可使這些差異可視化，并針對(duì)不同的藥用植物群體制定有效的保護(hù)措施。采用經(jīng)典的形態(tài)學(xué)分類方法研究藥用植物資源，是以個(gè)體性狀描述和宏觀水平上的觀測(cè)為基礎(chǔ)，得到的結(jié)論往往不完善，且易引起爭(zhēng)論；而DNA分子標(biāo)記技術(shù)通過直接分析特定DNA片段在不同生物個(gè)體間存在的差異，從本質(zhì)上區(qū)分不同個(gè)體或群體，使藥用植物的資源學(xué)研究更加準(zhǔn)確科學(xué)[87]。分子標(biāo)記的應(yīng)用有助于了解藥用植物資源的進(jìn)化歷史、種群間關(guān)系及種群動(dòng)態(tài)，從而進(jìn)一步制定合理的物種保護(hù)和種群控制措施[88]。此外，利用DNA分子標(biāo)記研究瀕危藥用植物遺傳多樣性，有助于評(píng)估特定居群的保護(hù)價(jià)值，并進(jìn)一步制定具體、科學(xué)的瀕危藥用植物保護(hù)措施，包括引種栽培、遷地保護(hù)、規(guī)劃自然保護(hù)區(qū)等[89]。

3.4 分子標(biāo)記在遺傳圖譜構(gòu)建及輔助育種上的應(yīng)用

遺傳圖譜作為植物的遺傳信息檔案，對(duì)育種工作具有極大的參考價(jià)值。一個(gè)高密度的遺傳圖譜能幫助較為精準(zhǔn)地定位到控制重要經(jīng)濟(jì)性狀的基因，顯著縮短育種年限，加快育種進(jìn)程。分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展推動(dòng)了植物遺傳圖譜的構(gòu)建，在2000年前已完成了大部分重要作物的RFLP遺傳連鎖圖。必須是通過連續(xù)幾代的選擇培育、系譜關(guān)系清楚的種質(zhì)群體，才能用于遺傳圖譜的構(gòu)建。但對(duì)藥用植物而言，其中多數(shù)生產(chǎn)周期長(zhǎng)、栽培歷史短、遺傳背景不明確，很難達(dá)到構(gòu)建遺傳圖譜的條件[90-92]。宗成堃等[93]利用SSR、SRAP、和ISSR標(biāo)記構(gòu)建了首張丹參的遺傳連鎖圖譜，為丹參相關(guān)數(shù)量性狀的基因定位、分離以及克隆奠定了重要基礎(chǔ)。沈奇等[94]利用SNP標(biāo)記選育出具有葉籽兩用、豐產(chǎn)、高抗、耐瘠等特性，可做綠肥使用的中研肥蘇1號(hào)紫蘇新品種。

3.5 分子標(biāo)記在藥用植物品質(zhì)性狀及抗病性研究中的應(yīng)用

由于藥用植物品種多、生長(zhǎng)環(huán)境復(fù)雜多樣，且大部分為多年生植物，導(dǎo)致其在生長(zhǎng)發(fā)育過程中易受各種病害的威脅，引起產(chǎn)量和質(zhì)量的雙重下降，不利于中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。實(shí)踐證明，培育優(yōu)質(zhì)抗病品種是控制藥用植物病害、保證藥用植物品質(zhì)最為安全有效的措施。常規(guī)育種方法育種周期長(zhǎng)、效率低，且易受環(huán)境因素和育種者經(jīng)驗(yàn)的影響，尤其是藥用植物病害種類繁多、鑒定復(fù)雜，更加不利于育種工作的實(shí)施。DNA分子標(biāo)記技術(shù)將DNA序列信息與藥用植物優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病等表型相關(guān)聯(lián)，通過該技術(shù)研究與藥用植物品質(zhì)、抗病性相關(guān)的功能基因，可輔助新品種的選育、提升藥用植物質(zhì)量，且具有高度穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和高效性[95-96]。

蘇建榮等[97]將RAPD標(biāo)記與云南紅豆杉不同器官紫杉醇含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明不同云南紅豆杉群體間樹皮、小枝和針葉的紫杉醇含量均差異顯著，同時(shí)篩選出了可指示各器官紫杉醇含量的特異標(biāo)記。董林林等[98]通過篩選與三七抗病相關(guān)的SNP位點(diǎn)，選育出與常規(guī)栽培種相比，種苗根腐病及銹腐病的發(fā)病率分別下降83.6%、71.8%的三七品種。黃靜等[99]通過將番茄SSR位點(diǎn)與品質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，找到9個(gè)與番茄總酸、成熟前果色、成熟果色、果面棱溝、番茄紅素相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，為培育高品質(zhì)的番茄提供理論基礎(chǔ)。此外，陸海燕等[102]通過開發(fā)KASP標(biāo)記位點(diǎn)成功區(qū)分玉米的雜種優(yōu)勢(shì)群。Zhao等[100]通過SSR標(biāo)記從120個(gè)葡萄品種中篩選出抗霜霉病品種。Feng等[101]利用SSR找出與丹參酚酸含量相關(guān)的QTL位點(diǎn)。付必勝等[103]開發(fā)了與小麥抗白粉病基因Pm48緊密連鎖的分子標(biāo)記。張鵬等[104]利用特異性位點(diǎn)擴(kuò)增片段測(cè)序(SLAF-seq)技術(shù)開發(fā)黃瓜白粉病抗性分子標(biāo)記。卿冬進(jìn)等[105]利用抗稻瘟病基因Pigm序列與其等位基因Pi2、Pi9及感病品種中等位基因的序列差異，結(jié)合PARMS技術(shù)(Penta-primer amplification refractory mutation system)，建立Pigm基因的熒光分子標(biāo)記。陳大霞等[106-107]利用目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(SCOT)標(biāo)記將8個(gè)黃花蒿品種聚為2類，并通過相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(SRAP)標(biāo)記了青蒿素含量較高的4個(gè)產(chǎn)地的黃花蒿之間的多態(tài)位點(diǎn)，有利于品種選育過程中有益基因的相互滲透。Asghari等[108]也利用特征性片段擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)標(biāo)記篩選出蒿屬植物中青蒿素含量較高的品種。因此，通過分子育種的方法，結(jié)合表型和基因型，可縮短育種年限，提高育種效率，并篩選出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗性強(qiáng)的藥用植物新品種。

4 展望

綜上所述，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在藥用植物種質(zhì)資源與道地性評(píng)價(jià)、親緣關(guān)系研究及品種與真?zhèn)舞b定等領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用。藥用植物種質(zhì)資源是中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，對(duì)其深入研究是培育優(yōu)良品種、保障藥用植物產(chǎn)量和質(zhì)量、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)中藥材的前提條件。另一方面，藥用植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究又是遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位及標(biāo)記等技術(shù)的基礎(chǔ)。因此，應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)藥用植物種質(zhì)資源的各個(gè)方面進(jìn)行深入研究是推動(dòng)我國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展、實(shí)現(xiàn)中藥材生產(chǎn)現(xiàn)代化的重要舉措。但無論是在廣度還是深度上，當(dāng)前藥用植物研究所涉及的分子標(biāo)記類型仍有不足，且存在較大的發(fā)展空間。以后的研究可從以下幾方面著手：1)研究開發(fā)更多、更高效的分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出具有高多態(tài)性的引物和探針；2)開發(fā)新型分子標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建對(duì)應(yīng)的分子標(biāo)記連鎖圖譜；3)建立表型與基因型相關(guān)聯(lián)的遺傳信息數(shù)據(jù)庫，推動(dòng)開展分子設(shè)計(jì)育種。伴隨著基因組學(xué)和生物信息學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記必將在藥用植物研究中得到更加廣泛的應(yīng)用，利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建藥用植物的遺傳連鎖圖譜，開發(fā)藥用植物重要品質(zhì)性狀的分子標(biāo)記，開展種質(zhì)資源遺傳信息和有效成分相關(guān)性的研究，必將成為今后藥用植物分子標(biāo)記輔助育種研究的重點(diǎn)。