茄子花藥誘導(dǎo)胚狀體研究

梁寶萍，王 勇，趙紅星，李 艷，姜 俊，段 瑩

(駐馬店市蔬菜遺傳育種工程技術(shù)研究中心 駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院,河南 駐馬店 463000)

花藥培養(yǎng)是獲得單倍體的有效途徑之一，縮小育種群體規(guī)模和年限，提高選擇效率[1]對選育自交系和新品種具有重要意義，已成功應(yīng)用于育種工作[[2]。用此手段育成的卵圓茄“花海茄二號”是一個(gè)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)卵圓花培品種。茄子花藥培養(yǎng)獲得植株途徑一般有2條，第一，發(fā)育胚狀體，直接形成植株；第二，先發(fā)育成愈傷組織，愈傷組織上面長生長點(diǎn)發(fā)育成植株。通過第一條途徑具有生長周期短，獲得單倍體效率高，有效避免混倍現(xiàn)象，能長期保持高度的分化能力，遺傳上也相對穩(wěn)定[3]。目前已經(jīng)有很多種植物通過誘導(dǎo)花藥成功培育出了單倍體植株，如甘藍(lán)、煙草等是較易于獲得單倍體的植株，而有些如茄子，番茄等頑拗性植株很難獲得單倍體植株[4]。茄子再生苗發(fā)育途徑大多是通過愈傷組織或者愈傷組織再生成胚成苗，而直接通過胚狀體途徑成苗的很少[5]。

研究茄子花藥預(yù)處理以及激素種類和配比對茄子胚狀體誘導(dǎo)的影響，建立茄子花藥胚狀體成苗體系，為茄子單倍體育種在生產(chǎn)實(shí)踐上提供一定的技術(shù)支持，應(yīng)加強(qiáng)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試栽培品種15個(gè)，編號分別為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7、Q8、Q9、Q10、Q11、Q12、Q13、Q14、Q15，均由駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所提供。2017年3月育苗，4月底定植于試驗(yàn)地。定期疏花疏果，植株保持開花狀態(tài)，其他常規(guī)田間管理。

表1 供試基因型材料

1.2 方法

1.2.1 材料采集 適于茄子花藥的誘導(dǎo)時(shí)期(小孢子多數(shù)在單核期靠邊期)，參照張玉苗的研究，采集同一栽培條件下，不同品種的茄子花冠長與花蕾萼基部之差0～2mm[6]的花蕾。

1.2.2 低溫預(yù)處理 花蕾放入4℃冰箱中進(jìn)行低溫預(yù)處理，設(shè)置處理時(shí)間梯度0、1、2、3、4、5、6、7 d選取有效的低溫處理時(shí)間。

1.2.3 外植體的消毒和接種 在低溫預(yù)處理后的花蕾中倒入75%酒精消毒后立即用0.1%升汞消毒6 min，之后 10 min之內(nèi)用無菌水沖洗4次。放無菌濾紙上，用茄子剝出花藥進(jìn)行接種。

1.2.4 高溫處理 花藥接種后在36 ℃下暗培養(yǎng)0、2、4、6、8、10、12 d，選取高溫誘導(dǎo)最高頻率時(shí)間；對照為直接放置于25℃黑暗條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理接種6皿，每皿接種10個(gè)花藥，重復(fù)3次。

1.2.5 變溫處理 先低溫處理3 d，接種后統(tǒng)一36℃高溫培養(yǎng)2、4、6、8 d，每個(gè)處理接種6皿，每皿接種10個(gè)花藥，重復(fù)3次。

1.2.6基因型的選擇 15個(gè)栽培品種花藥接種到MS添加激素2,4-D 0.2 mg·L-1、KT 0.2 mg·L-1的固體培養(yǎng)基上，蔗糖3 %；4℃低溫處理3 d，比較不同品種出胚能力，篩選出胚率最高的品種。

1.2.7 篩選培養(yǎng)基 在基本培養(yǎng)基MS上，分別附加激素濃度梯度組合2,4-D、KT、NAA共19個(gè)，蔗糖濃度為3 %，瓊脂6 g·L-1，pH5.8。

1.2.8 胚狀體誘導(dǎo) 將消毒后的花蕾在無菌的條件下接種在同1.2.7的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種10枚花蕾，重復(fù)3次，直到出胚。觀察胚狀體產(chǎn)生和分化的條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選易出胚品種

不同品種的花藥接到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1上，觀察不同品種出胚率。結(jié)果表明，不同基因型材料出胚能力有局限性，在15個(gè)基因型品種中只有Q6，Q10具有出胚能力，說明不同品種基因型是影響茄子花藥出胚率的重要因素之一[7]。

2.2 胚狀體產(chǎn)生對溫度的敏感度

2.2.1 胚狀體產(chǎn)生對低溫脅迫的敏感度 將Q6、Q10接種到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，低溫脅迫對茄子花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體有不同敏感度，不進(jìn)行低溫脅迫也能誘導(dǎo)出胚狀體，當(dāng)?shù)蜏孛{迫3 d時(shí)胚狀體誘導(dǎo)率最高，Q6為0.7%，Q10為0.4%，之后有所下降。結(jié)果表明，第一，低溫脅迫對茄子花藥胚狀體誘導(dǎo)有一定的敏感度，第二，茄子誘導(dǎo)胚狀體低溫最敏感的時(shí)間是脅迫3 d。

圖1 低溫處理對胚狀體誘導(dǎo)率的影響

2.2.2 胚狀體產(chǎn)生對高溫脅迫的敏感度 將Q6、Q10接種到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示，高溫脅迫提高了出胚率，且Q6高溫脅迫6d，出胚率達(dá)到最高，出胚率為5%。當(dāng)高溫脅迫天數(shù)超過6 d時(shí)出胚率急劇下降，12 d時(shí)出胚率達(dá)到最低，Q10在高溫脅迫4 d時(shí)出胚率最高，為8%。研究結(jié)果表明，第一，高溫脅迫對茄子胚狀體誘導(dǎo)有所提高；第二，茄子花藥對高溫處理時(shí)間較敏感；第三，Q6與Q10高溫脅迫誘導(dǎo)率趨勢保持一致，但是胚狀體誘導(dǎo)頻率最高時(shí)間不一致，說明不同品種之間誘導(dǎo)胚狀體高溫脅迫有差異。

圖2 高溫處理對胚狀體誘導(dǎo)率的影響

2.2.3 變溫處理 將Q6、Q10在4 ℃處理3 d后，接種到MS+2,4-D 0.2 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基上，再36℃高溫處理,研究結(jié)果表明，第一，變溫處理出胚率高于高溫處理出胚率，第二低溫處理和高溫處理具有一定的疊加效應(yīng)。第三，適當(dāng)?shù)牡蜏靥幚砟芴岣吲郀铙w誘導(dǎo)率。第四，低溫處理(4℃)3 d+高溫(36℃)6 d是胚狀體誘導(dǎo)的最佳溫度和時(shí)間，Q6變溫處理的最高出胚率為8.9%，Q10的最高出胚率為11.3%。

圖3 孌溫處理和高溫處理對2個(gè)茄子花藥胚狀體誘導(dǎo)率的影響

2.3 胚狀體對激素組合處理的敏感度

由表2看出，茄子胚狀體產(chǎn)生與激素濃度和配比敏感度密切相關(guān)， Q6在培養(yǎng)30 d后產(chǎn)生胚狀體，培養(yǎng)10d之后產(chǎn)生綠色分化出子葉的綠苗，移栽成苗。2,4-D 0.2 mg·L-1+KT l mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高，為20%，其次是2,4-D 0.2 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為16%。

3 討論與結(jié)論

雄核在溫度脅迫下，細(xì)胞代謝機(jī)制和遺傳表達(dá)效應(yīng)發(fā)生改變，發(fā)育偏離正常發(fā)育途徑[8]，轉(zhuǎn)向胚狀體發(fā)生方向，只有脅迫條件下小孢子胚性化程序才能啟動[9]。低溫脅迫3 d，然后高溫6 d脅迫是胚狀體誘導(dǎo)率最高的時(shí)間，Q6變溫處理的最高出胚率為8.9%，Q10的最高出胚率為11.3%。范適在花藥預(yù)處理以低溫(4℃)處理4d+高溫(36℃)處理6d的效果最佳[10]，這與前人的結(jié)果相似，說明低溫和高溫脅迫對胚狀體產(chǎn)生有疊加效應(yīng)，經(jīng)低溫和高溫脅迫達(dá)到一定程度后能有效改變花藥內(nèi)源激素、蛋白質(zhì)、mRNA、糖類等含量的變化，進(jìn)而提高小孢子的生活力[11]。

表2 不同濃度激素組合對Q6胚狀體誘導(dǎo)的影響

劉獨(dú)臣在茄子花藥誘導(dǎo)胚狀體時(shí)，基因型E3低溫處理2 d胚狀體誘導(dǎo)率高達(dá)18%[12]，而也有報(bào)道在35℃高溫處理2 d獲得了5.1%的胚狀體誘導(dǎo)率[13]。此次試驗(yàn)中低溫脅迫之后，誘導(dǎo)率3 d之后頻率最高，基因型Q6和Q10的誘導(dǎo)率僅為0.7%和0.4%，高溫處理后，基因型Q6和Q10的胚狀體誘導(dǎo)率在6d之后，胚狀體誘導(dǎo)率最高，分別為5%和8%。在前人的研究中單獨(dú)的高溫和低溫處理都能達(dá)到較高得胚狀體誘導(dǎo)率，這與前人的研究不一致。這可能是與品種有關(guān)，不同品種之間有不同程度的差異。

細(xì)胞分裂素和生長素之比反應(yīng)根和芽的發(fā)育，比值高時(shí)促進(jìn)不定芽的分化，反之促進(jìn)根的形成[14]。2,4-D 0.2 mg·L-1+KT l mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，這種激素組合濃度產(chǎn)生胚狀體，誘導(dǎo)效率最高為20%。這說明內(nèi)源激素加外源激素達(dá)到一定平衡才能啟動胚狀體誘發(fā)的能力。三種激素的組合比兩種激素組合胚狀體誘導(dǎo)率低，有待研究多種激素濃度組合誘導(dǎo)效果。

筆者研究改良了培養(yǎng)條件， Q6和Q10成功獲得了胚狀體，15個(gè)品種中，只有Q6，Q10具有出胚能力。花藥產(chǎn)生胚狀體頻率不高，第一，應(yīng)進(jìn)一步研究控制花藥培養(yǎng)胚狀體產(chǎn)生的有關(guān)數(shù)量性狀基因組合，便于尋找更有效的基因型，從根本上利用花藥培養(yǎng)的基因型，促進(jìn)花藥培養(yǎng)的誘導(dǎo)率。