miR122/155在慢性胰腺炎肝損傷中的作用

王宏鑫，王振國，趙 琳，程 明

(1.武警特色醫(yī)學(xué)中心 急診醫(yī)學(xué)科，天津300162；2.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)科，上海200081；3.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院 普外科，上海200081)

慢性胰腺炎(chronic pancreatitis，CP)是多種病因引起的胰腺組織和功能不可逆改變的慢性炎癥性疾病，其病理特征為胰腺實(shí)質(zhì)損傷、間質(zhì)纖維化,并可伴肝功能損傷[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(microRNA，miR)在CP患者血清中表達(dá)升高，在CP中發(fā)揮重要作用[2]。miR122/155是兩個研究廣泛的miRs，在急性胰腺炎患者血清中表達(dá)升高[3,4]，在CP中作用未有報道?；谏鲜鲅芯浚覀冎饕接慍P肝損傷患者血清中miR122/155表達(dá)水平及臨床意義，并通過動物實(shí)驗(yàn)挖掘miR122/155對肝損傷的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床研究

1.1.1一般資料 選取2018年6月至2019年3月收治的30例CP患者為研究組(CP組)，納入標(biāo)準(zhǔn)/排除標(biāo)準(zhǔn)為2018版《慢性胰腺炎診治指南》[1]確診且除外肝膽疾病及惡性腫瘤患者。隨機(jī)選同期體檢健康30人為對照組(CON組)。研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)并與參研人員簽署《知情同意書》,見表1。

表1 一般資料

1.1.2標(biāo)本采集 入院次日空腹取研究組靜脈血5 ml于抗凝管，3 000 r/min離心15 min，血清分于無RNA酶離心管置于-80℃下保存。對照組標(biāo)本于體檢時留取。

1.1.3主要材料與儀器 總RNA提取試劑盒及7500實(shí)時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR，qPCR)儀購自美國Applied Biosystems 公司，qPCR擴(kuò)增試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自蘇州吉瑪基因有限公司。

1.1.4主要方法

①肝功能各指標(biāo)依靠檢驗(yàn)科生化分析儀測定。

②qPCR 提取各組總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA-microRNA。以U6為內(nèi)參、cDNA為模板，擴(kuò)增目標(biāo)miRs。步驟參考說明書，每個目的基因重復(fù)3次。引物序列見表2。

表2 引物序列

1.2 動物實(shí)驗(yàn)

1.2.1主要材料與儀器 C57BL/6小鼠購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，蛙皮素購自美國Sigma公司，TLR4、NF-κB、β-actin一抗及二抗購自美國Proteintech公司。Western Blot設(shè)備購自美國BioRad公司。

1.2.2主要方法

①CP模型構(gòu)建 模型(CP’)組小鼠按50 μg/kg蛙皮素腹腔注射，頻次為1次/h×6次/d×3d/w×4w[5]；對照(CON’)組小鼠同期注射等量生理鹽水。

②Masson染色 4%多聚甲醛固定胰頭并制備病理切片。將切片脫蠟、染色、脫水、透明而后中性樹脂封片。

③肝功能測定同臨床研究。

④qPCR同臨床研究。

⑤Western Blot 提小鼠肝組織總蛋白并電泳分離及轉(zhuǎn)膜，而后孵育抗體、顯影。條帶灰度值以Image J測取。

2 結(jié)果

2.1 CP患者肝功能結(jié)果

CP患者中6人肝功能尚正常，其余患者各指標(biāo)均不同程度升高，其中AST、ALT、γ-GT、ALP變化顯著，與CON組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 肝功能結(jié)果

與CON組相比：*P<0.05

2.2 CP患者血清miR122/155表達(dá)水平

與CON組相比，CP組血清miR122/155表達(dá)均顯著升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。肝功能受損的CP患者(CP2組)與肝功能尚正常的CP患者(CP1組)相比，miR122/155表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異。見表4。

表4 血清miR122/155表達(dá)水平

與CON組相比：*P<0.05

2.3 CP患者血清miR122/155與肝功能指標(biāo)相關(guān)性

分析表3中有統(tǒng)計學(xué)差異指標(biāo)與miR122/155的相關(guān)性。結(jié)果表明，AST、ALT、ALP與miR122表達(dá)呈正相關(guān)，AST、γ-GT、ALP與miR155呈正相關(guān)(#P<0.05)。見表5。

表5 miR122/155與肝功能指標(biāo)相關(guān)性

#P<0.05表示有顯著相關(guān)

2.4 CP小鼠血清miR122/155及AST、ALP表達(dá)情況

如圖1所示， CP’組小鼠胰腺間質(zhì)中充滿藍(lán)染的膠原纖維等成分，說明模型構(gòu)建成功。檢測小鼠血清miR122/155、AST、ALP表達(dá)，結(jié)果顯示， 其在CP’組中表達(dá)高于CON’組(P<0.05)。見表6。

圖1 小鼠胰腺M(fèi)asson染色

表6 小鼠血清miR122/155、AST、ALP表達(dá)

與CON’組相比：△P<0.05

2.5 小鼠肝組織中TLR4、NF-κB表達(dá)情況

與CON’組相比，CP’組中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 小鼠肝組織中TLR4、NF-κB表達(dá)

與CON’組相比：△P<0.05

3 討論

CP癥狀頑固遷延不愈，亟需攻克。目前膽道疾病、酗酒仍是我國CP致病主要因素，此外，遺傳因素在CP發(fā)病中也具有重要作用，常見易感基因包括PRSS1、CTRC、CFTR等[1]?；虮磉_(dá)受復(fù)雜的信號通路調(diào)控，而miRs廣泛參與信號通路的激活，在CP發(fā)病中亦發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，具有作為CP生物標(biāo)記物的潛能[2]。

miRs為非編碼小分子RNA，廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，干擾mRNA翻譯，在胰腺炎中有重要作用。胰腺纖維化(pancreatic fibrosis,PF)是CP核心病理過程，而胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell,PSC)活化在此過程中具有關(guān)鍵作用，可受到miR21等多種miRs的調(diào)節(jié)[6,7]。miR21在激活PSC過程中伴有結(jié)締組織生長因子2表達(dá)升高，且二者形成正反饋環(huán)，通過外泌體形式傳遞給其他PSC，共同促進(jìn)PSC級聯(lián)激活[6]。除正向調(diào)節(jié)外，有些miRs也可負(fù)向調(diào)控CP，即抑制PF發(fā)展，如miR200家族，在CP中表達(dá)與PF程度及miR21表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)[8]。目前對CP發(fā)病有關(guān)的miRs研究還很少，雖通過基因芯片初篩出許多可正負(fù)調(diào)節(jié)CP的miRs[7]，但進(jìn)一步研究還需大量工作。miR122/155是兩個與炎癥調(diào)節(jié)有關(guān)的miRs，在急性胰腺炎、肝損傷中研究廣泛[3,4,9]，而在CP中作用鮮有報道。我們發(fā)現(xiàn)，CP患者血清miR122/155表達(dá)均比正常人顯著升高，提示這兩個miRs可能在CP發(fā)病中具有重要作用。胰腺炎的發(fā)展會產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，常伴有肝臟損傷，導(dǎo)致AST、ALP等升高[10]，這種胰腺炎相關(guān)肝損傷(PALI)發(fā)生也可能與miR122/155表達(dá)升高有關(guān)。相關(guān)性分析表明，CP患者血清miR122/155表達(dá)與AST、ALT、ALP表達(dá)成正相關(guān)。由此可見，miR122/155在CP肝損傷中具有重要意義。

進(jìn)一步我們構(gòu)建了CP小鼠模型，發(fā)現(xiàn)CP小鼠存在一定程度肝損傷，且血清中miR122/155表達(dá)升高，這種結(jié)果與CP患者情況一致。在此基礎(chǔ)上，我們又初步探討CP肝損傷的可能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)TLR4/NF-κB通路被激活，由此推測該通路可能參與CP肝損傷過程。TLR4/NF-κB通路是常見的炎癥通路，在胰腺炎、肝炎中廣泛存在。Wang[11]等最近研究發(fā)現(xiàn)，在PALI大鼠模型中，TLR4通路被激活。此外，肝損傷中激活的TLR4通路可受到miR122/155調(diào)節(jié)[12]。據(jù)此我們推測，在CP發(fā)病過程中miR122/155可能是通過TLR4/NF-κB通路發(fā)揮對肝的損傷作用。

綜上所述，miR122/155在CP中表達(dá)升高，是CP潛在的生物標(biāo)記物；miR122/155與CP肝損傷發(fā)生呈正相關(guān)，這種損傷可能與TLR4/NF-κB通路激活有關(guān)，確切的調(diào)節(jié)機(jī)制還需相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。