DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3(DNMT 3)在乳腺癌患者中的表達(dá)及意義

潘小平，洪曉綠，孟 萍，裴德翠，程延?xùn)|，姚明媚，王 蓉

(廣東省廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院 1.檢驗科;2.感染科;3.中心實驗室;4.輸血科;5.乳腺外科,廣東 廣州 510800)

我們前期研究證實：內(nèi)皮素-3基因在乳腺癌患者中表達(dá)顯著減少[1]，其原因是該基因DNA啟動子發(fā)生了甲基化[2]，而DNA甲基化過程是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化完成。目前研究發(fā)現(xiàn)的DNMT家族(DNMTs)成員至少包括DNMT l、DNMT 2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L，現(xiàn)報道DNMT 3(DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L)在乳腺癌患者中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2018-04-01—2018-11-30在本院接受手術(shù)的乳腺癌患者60例作為實驗組，年齡36-85歲，平均(54.3±12.0)歲，另選同期體檢健康女性50例作為對照組，年齡23-74歲，平均(43.8±14.0)歲，兩組年齡間無統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.542，P=0.726)。實驗組各臨床特征總例數(shù)及比例見表1，病理TNM分期按照WHO2003乳腺癌分類標(biāo)準(zhǔn)[3]，所有測試者清晨空腹采集外周血2 ml貯存于EDTA抗凝管中，實驗組臨床資料完善且術(shù)前均未經(jīng)任何治療。

1.2 主要儀器及試劑Trizol(9109，Invitrogen)，SYBR RT-PCR試劑盒(RR820A，TaKaRa)，DNase (M610A，Promega)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A，TaKaRa)，EasyPure Blood RNA Kit(天根，ER401-1)熒光定量PCR儀(CFX96，BIO-RAD)，數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(LG2000)，X 射線攝影暗匣(AX-Ⅱ)，Mini型蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-rad，美國)。

1.3 RT-PCR參照Invitrogen公司的Trizol試劑盒說明書提取實驗組和對照組外周血單個核細(xì)胞總RNA，使用DNase I試劑提純；紫外分光光度儀測定A260/A280值在1.8-2.0之間，純度較高；瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶均清晰可見，RNA抽提較完整條帶；采用TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，-80℃保存?zhèn)溆茫话凑誘aKaRa 定量試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR，引物見表2，采用2-△△Ct法計算其相對表達(dá)量，其中△CT=CT目的基因-CT內(nèi)參基因，△△CT=△CT-△CT對照組最大值，每個樣品重復(fù)3次，取平均Ct值。

1.4 Western blot隨機選取實驗組和對照組外周血標(biāo)本各4份，1500 r/min離心15 min，分離血漿，按照蛋白提取試劑盒說明書提取血漿總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白進(jìn)行定量分析，取10-100 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(濃縮膠：60-100V，30 min，分離膠：100-200V，60 min)，切下含有目的蛋白的膠條轉(zhuǎn)至PVDF膜(DNMT3A:300 mA，120 min;DNMT3B:300 mA，90 min;DNMT3L:300 mA，60 min)，室溫封閉1-2 h，TBST洗膜后加兔抗人DNMT3A、DNMT3B、DNMT3L IgG抗體(BIOSS 1∶2000)；內(nèi)參加入兔抗人GAPDH抗體(abcam 1∶2000)，4℃孵育過夜后，分別加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(SANTA CRUZ 1∶4000)室溫孵育2 h，顯色1-5 min后洗片，顯影。

表1 實驗組各臨床特征總例數(shù)及比例

表2 實驗所用引物序列

2 結(jié)果

2.1 DNMT 3A mRNA、DNMT 3B mRNA、DNMT 3L mRNA在兩組間的表達(dá)比較

結(jié)果顯示，實驗組DNMT3A mRNA、DNMT 3B mRNA表達(dá)較對照有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異，而實驗組DNMT 3L mRNA表達(dá)量較對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表3。

表3 兩組間DNMT 3A mRNA、DNMT3B mRNA、DNMT 3L mRNA表達(dá)量比較

2.2 不同臨床特征乳腺癌患者DNMT 3A mRNA、DNMT 3B mRNA的表達(dá)比較

在不同臨床特征的比較中，僅DNMT 3A mRNA的表達(dá)在組織學(xué)類型上有統(tǒng)計學(xué)差異；而DNMT 3B mRNA的表達(dá)在不同臨床特征中均無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果見表4。

表4 不同臨床特征乳腺癌患者DNMT 3A mRNA、DNMT3B mRNA表達(dá)量比較

注：*方差不齊；1：N0與N1比較；2：N0與N2比較；3：N0與N3比較；4：N1與N2比較；5：G1與G2比較；6：G2與G3比較；7：G1與G3比較

2.3 DNMT 3A、DNMT 3B、DNMT 3L蛋白在兩組中的表達(dá)

結(jié)果顯示DNMT3A和DNMT3B蛋白在實驗組中高表達(dá)，在對照組中無表達(dá)，見圖1和圖2；而DNMT3L蛋白在實驗組和對照組中均無表達(dá)，見圖3。

圖1 DNMT3A蛋白WB圖

1-4號位置對應(yīng)實驗組隨機挑選標(biāo)本，5-8號位置為對照組隨機挑選標(biāo)本。

圖2 DNMT3B蛋白WB圖

1-4號位置對應(yīng)實驗組隨機挑選標(biāo)本，5-8號位置為對照組隨機挑選標(biāo)本。

圖3 DNMT3L蛋白WB圖

1-4號位置對應(yīng)實驗組隨機挑選標(biāo)本，5-8號位置為對照組隨機挑選標(biāo)本。

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，全球每年約有120萬女性罹患此疾病，其發(fā)病率以每年2%的速度遞增[4]，嚴(yán)重危害女性身心健康。乳腺癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，發(fā)病機制呈多元化，包括非基因因素和基因因素[5]，內(nèi)皮素(Endothelin,EDN)基因可能是乳腺癌易感基因之一，在我們以前的研究中也證實了EDN基因與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6，7]。

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，在腫瘤基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞增殖分化等方面起重要作用，并與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，已證實DNA甲基化與許多腫瘤相關(guān)，如腸癌[8]，肺癌[9]，膀胱癌[10]等，也包括乳腺癌[11]。我們前期研究證實:EDN-3基因在乳腺癌患者存在較高程度的DNA甲基化發(fā)生率[2]，而DNA甲基化過程是由DNMT酶催化S-腺苷蛋氨酸上的甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶含氮雜環(huán)5′位上的修飾反應(yīng)，是負(fù)責(zé)將甲基基團(tuán)添加至CpG二核苷酸的酶[12]，該酶與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)的DNMT家族(DNMTs)成員至少包括DNMT l、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。

DNMT3A和DNMT3B在早期胚胎細(xì)胞中高度表達(dá)，細(xì)胞分化后在成體細(xì)胞組織中表達(dá)下調(diào)，但在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)[14]，它們具有合并從頭甲基化CpG島啟動子功能，在人類癌細(xì)胞中可能是抑癌基因失活機制之一[15]；DNMT3L是最近幾年發(fā)現(xiàn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，其功能不詳。DNMT 3過表達(dá)在許多惡性腫瘤中起重要作用，如胃癌[16]、子宮內(nèi)膜癌[17]、肺癌[18]等。

我們檢測了60例乳腺癌患者外周血中DNMT 3A的表達(dá)水平，結(jié)果表明，它在乳腺癌患者外周血中高表達(dá)，這與Jahangiri R等研究的結(jié)論一致[19]，提示DNMT 3A能促使乳腺癌的發(fā)生，然而在不同臨床特征的比較中，其表達(dá)差異僅見于組織學(xué)等級。DNMT 3B在乳腺癌中的作用尚有爭議，雖然我們的研究與Eftekhar E等的研究類似，即DNMT3B在乳腺癌中高表達(dá)，其促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生與DNMT 3A有高度相似性[20]，但Sun M等研究表明，DNMT 3B與乳腺癌的發(fā)生并無關(guān)聯(lián)[21]；另外，Kar S等研究表明DNMT 3B僅在乳腺癌初期高表達(dá)[22]，而在我們的研究中DNMT 3B在乳腺癌不同分期中表達(dá)無差異，結(jié)論不一致的原因可能為：(1)研究的乳腺癌人群不一樣，可能存在基因表達(dá)上的差異；(2)統(tǒng)計方法可能存在差異。在我們的研究中并未發(fā)現(xiàn)DNMT 3L與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)，其原因可能是它本身并沒有催化DNA甲基化的活性，但可使DNMT3A和DNMT3B與DNA結(jié)合的更加牢固，并通過這種方式來增強DNA的從頭甲基化過程[23,24]。然而，DNMT3在乳腺癌組織中的表達(dá)情況如何，是本研究下一步亟待研究的內(nèi)容。

綜上所述，DNMT 3A和 DNMT 3B在乳腺癌患者外周血中均過量表達(dá)，而DNMT3L在乳腺癌患者外周血中表達(dá)不顯著，因此，臨床工作中，可將DNMT 3A和 DNMT 3B作為乳腺癌的輔助檢查之一，能為乳腺癌的篩查、診斷、病情監(jiān)測等提供幫助，適宜在臨床工作中開展。