一對(duì)大前庭導(dǎo)水管綜合征育齡夫婦遺傳咨詢研究

唐克峰 沈國(guó)松 李 志 婁志武

大前庭導(dǎo)水管綜合征（larged vestibular aqueduct syndrome，LVAS）是一種以前庭水管擴(kuò)大伴有感音神經(jīng)性聾為特征的常染色體隱性遺傳性非綜合征型聽(tīng)力障礙疾病，其發(fā)病與SLC26A4 基因密切相關(guān)[1]。SLC26A4 基因位于7q31，含有21 個(gè)外顯子，開(kāi)放閱讀框架2343bp，每個(gè)內(nèi)含子與外顯子的界線分明，SLC26A4 基因編碼一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能都十分復(fù)雜的蛋白質(zhì)Pendrin[2]。該蛋白由780 個(gè)氨基酸組成，主要表達(dá)于內(nèi)耳的內(nèi)淋巴管和淋巴囊，介導(dǎo)OH-、I-、Cl-和HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)，維持內(nèi)淋巴液的離子平衡，對(duì)內(nèi)耳內(nèi)淋巴液再吸收具有不可或缺的作用[3]。SLC26A4 基因的突變譜很廣泛，目前世界范圍內(nèi)約有240 種以上的突變報(bào)道與耳聾相關(guān)[4]。本研究中，筆者對(duì)1 對(duì)大前庭導(dǎo)水管綜合征聽(tīng)障育齡夫婦應(yīng)用目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序技術(shù)對(duì)聽(tīng)力障礙相關(guān)基因進(jìn)行突變檢測(cè)，明確其突變類型和突變形式，并探討其遺傳風(fēng)險(xiǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 丈夫30 歲，妻子29 歲，夫妻自訴出生時(shí)無(wú)異常，無(wú)耳毒性藥物應(yīng)用史，無(wú)外傷史，皆為2歲前出現(xiàn)對(duì)聲音反應(yīng)差，男方不能言語(yǔ)至今，女方可發(fā)出少量分辨不清晰言語(yǔ)。聽(tīng)力學(xué)檢測(cè)皆示雙耳重度感音神經(jīng)性聾，夫妻雙方MRI 檢查結(jié)果皆顯示雙側(cè)內(nèi)淋巴囊擴(kuò)大，提示大前庭導(dǎo)水管綜合征（見(jiàn)圖1）。專科檢查：夫妻雙方雙側(cè)耳廓未見(jiàn)畸形，外耳道及鼓膜未見(jiàn)明顯異常。男方父母及姐姐為聾啞人，但均拒絕基因檢測(cè)；女方為領(lǐng)養(yǎng)兒，家系成員情況不詳。另外選取100 名在我院做耳聾基因篩查聽(tīng)力正常且無(wú)聽(tīng)力障礙家族史的兒童作為正常對(duì)照組，均進(jìn)行SLC26A4 基因60 個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批號(hào)2013-007），研究對(duì)象均已簽署知情同意書(shū)。

圖1 大前庭導(dǎo)水管顳骨MRI 示意圖（A：男性；B：女性）

1.2 方 法

1.2.1 DNA 提取 應(yīng)用DNA 提取試劑盒（廈門(mén)致善生物公司，貨號(hào)603003，批號(hào)190614）提取所有耳聾患者的基因組DNA，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量待檢DNA 濃度及純度，取一定量的DNA 原液稀釋成20ng/μL 的工作濃度，-20℃保存?zhèn)溆?，DNA 原液-70℃保存。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 使用Aligent SureSelect 方法制備檢測(cè)樣本，實(shí)驗(yàn)方法遵照操作手冊(cè)，實(shí)驗(yàn)包括DNA 片段化處理、末端修復(fù)、加接頭、PCR 擴(kuò)增、探針雜交、磁珠捕獲富集等步驟。文庫(kù)經(jīng)2200 生物分析儀（Agilent）質(zhì)控分析合格后上機(jī)測(cè)序。采用Illumina HiSeq X-Ten 系統(tǒng)完成高通量測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用FastQC 軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析；利用BWA 軟件（v0.7.15-r1140）將所有過(guò)濾后的測(cè)序序列（reads）比對(duì)到參考基因組（GRCh37/hg19）；利用Picard 軟件工具去除重復(fù)reads；利用GATK 軟件工具包（v3.7-0）完成單堿基變異（SNV）和插入缺失變異（Indel）的檢出；利用Annovar 及VEP 等軟件包進(jìn)行注釋。

1.2.4 致病性變異過(guò)濾及篩選 結(jié)合人群基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)[dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)（SNP150）、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等]信息，去除MAF＞0.01（AD）或MAF＞0.05（AR）的高頻變異。參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關(guān)指南，結(jié)合疾病基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)（Clinvar、HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)）信息、文獻(xiàn)報(bào)道、功能試驗(yàn)、遺傳模式、基因型-表型關(guān)聯(lián)分析、預(yù)測(cè)軟件（mcap、REVEL 及CADD 等）預(yù)測(cè)結(jié)果等綜合判斷，將變異分成5 類：致病、可能致病、意義不明確、可能良性、良性；并篩選出與先證者表型相關(guān)的可疑致病性變異進(jìn)行Sanger 測(cè)序驗(yàn)證等進(jìn)一步分析。

1.2.5 Sanger 測(cè)序驗(yàn)證及共分離分析 通過(guò)以上方法篩選出的可疑致病基因變異，利用Primer3 軟件設(shè)計(jì)PCR 引物進(jìn)行擴(kuò)增（PCR 引物由中翰金諾醫(yī)學(xué)研究所設(shè)計(jì)，華大基因合成，見(jiàn)表1）及Sanger 測(cè)序分析。利用Mutation Surveyor 等軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 PCR 引物序列

2 結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)男方為SLC26A4c.230A ＞T、c.1174A＞T 和c.1547dupC 的復(fù)合雜合突變，Sanger 測(cè)序示意圖分別如圖2 所示。女方為SLC26A4c.919-2A＞G 和c.1547dupC 的復(fù)合雜合突變，Sanger測(cè)序示意圖分別如圖3 所示。而正常對(duì)照組100名檢測(cè)對(duì)象里SLC26A4 基因60 個(gè)位點(diǎn)未見(jiàn)任何突變。

圖2 本例聾啞夫婦男性的SLC26A4 基因突變位點(diǎn)Sanger測(cè)序結(jié)果

圖3 本例聾啞夫婦女性的SLC26A4 基因突變位點(diǎn)Sanger 測(cè)序結(jié)果

3 討論

20 世紀(jì)70 年代末隨著CT 問(wèn)世，LVAS 逐漸被認(rèn)識(shí)，它是遺傳性耳聾患兒中最常見(jiàn)的一種內(nèi)耳發(fā)育畸形性疾病，也是一種常染色體隱性遺傳性聽(tīng)力障礙性疾病[5]。其主要表現(xiàn)為雙側(cè)進(jìn)行性感音神經(jīng)性耳聾，影像學(xué)CT 或MRI 提示內(nèi)淋巴囊或前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大[6]。患病個(gè)體間聽(tīng)力損傷程度差別較大，聽(tīng)力范圍從完全正常到極重度聽(tīng)力障礙不等，咳嗽、頭部倒立、用力擤鼻涕以及劇烈體育運(yùn)動(dòng)等都可以造成聽(tīng)力損傷。早期臨床診斷或者基因診斷，結(jié)合正確的防護(hù)措施，有助于保護(hù)患者的聽(tīng)力，甚至能夠完全正常生存，提高生活質(zhì)量。

中國(guó)耳聾高發(fā)與中國(guó)人群常見(jiàn)耳聾基因突變的高攜帶率息息相關(guān)，其中SLC26A4 基因突變的攜帶率高達(dá)2%～3%，約80%LVAS 患者中可見(jiàn)SLC26A4突變[7]。再加上因?yàn)樯鐣?huì)原因，耳聾患者結(jié)為夫婦的概率大大增加。由于其耳聾基因攜帶率高，遺傳性耳聾比例高，從而導(dǎo)致生育后代耳聾概率大大高于普通婚配夫婦，因此耳聾夫婦成為高危人群應(yīng)該受到重點(diǎn)預(yù)防和干預(yù)。

有研究報(bào)道，SLC26A4 基因在我國(guó)最常見(jiàn)突變位點(diǎn)是c.919-2A＞G、c.2168A＞G、c.1174A＞T、IVSl5+5G＞A、c.1229C＞T 及c.1975G＞C，并且具有種族特異性[3]。其中c.919-2A＞G 單等位基因突變頻率為7.6%，該突變占SLC26A4 外顯子7 和8 中所有突變等位基因的99%，但復(fù)合雜合性在兩個(gè)突變等位基因的患者中占近60%，由此可見(jiàn)針對(duì)SLC26A4 基因所有位點(diǎn)進(jìn)行篩查是很有必要的[8-10]。c.919-2A＞G 為剪切位點(diǎn)變異，屬于功能缺失型變異。該變異可導(dǎo)致Pendrin 蛋白發(fā)生功能障礙，使得內(nèi)耳內(nèi)的淋巴液流動(dòng)發(fā)生異常，從而引起內(nèi)淋巴管內(nèi)壓升高和前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，最終內(nèi)耳毛細(xì)胞受損和聽(tīng)神經(jīng)萎縮出現(xiàn)聽(tīng)力下降[5]。c.1174A＞T 變異較c.919-2A＞G 罕見(jiàn)，屬于錯(cuò)義突變，導(dǎo)致氨基酸N392Y 改變，肖彩霞等[11]報(bào)道了1 例，李琦等[12]報(bào)道了3 例，Liu 等[13]報(bào)道過(guò)2例，但都沒(méi)有闡述具體的致病機(jī)制。C.230A＞T 和c.1547dupC 更是罕見(jiàn)，其中c.230A＞T 屬于錯(cuò)義變異，而c.1547dupC 屬于框移變異。C.230A＞T 突變導(dǎo)致K771 氨基酸的改變，從而影響整個(gè)pendrin 蛋白的功能[14]。C.1547dupC 突變導(dǎo)致了S517fs 氨基酸的改變，Liu 等[13]也報(bào)道過(guò)2 例。C.230A＞T、c.1174A＞T 和c.919-2A＞G 雖然都是罕見(jiàn)的突變，但是這三種突變極少出現(xiàn)純合突變，基本上都是以和SLC26A4 基因其他突變位點(diǎn)復(fù)合雜合的形式出現(xiàn)，都會(huì)導(dǎo)致不同程度的耳聾。

本研究中男性患者屬于SLC26A4 基因三個(gè)致病雜合突變的復(fù)合雜合子，而女性患者在相同的基因兩個(gè)致病雜合突變的復(fù)合雜合子，其中一個(gè)突變與男性相同。該男性的父母及姐姐都是聾啞人，很可能是從其父母SLC26A4 基因不同突變位點(diǎn)遺傳得來(lái)，導(dǎo)致三個(gè)位點(diǎn)的復(fù)合雜合子，這是比較罕見(jiàn)的，遺憾的是他的父母及姐姐拒絕基因檢測(cè)。而女方是比較常見(jiàn)的LVAS 復(fù)合雜合子患者，其基因的來(lái)源也因?yàn)槭穷I(lǐng)養(yǎng)兒而不能追尋。但根據(jù)單基因遺傳病的孟德?tīng)栠z傳定律，該對(duì)夫婦生育LVAS 患兒的風(fēng)險(xiǎn)為100%，可不生育、領(lǐng)養(yǎng)、供精或供卵形式獲取健康后代。由此可見(jiàn)，我們通過(guò)對(duì)聾人夫婦的耳聾基因進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行遺傳咨詢，可以避免遺傳風(fēng)險(xiǎn)明確的夫婦生育耳聾后代，有效降低耳聾的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。