基于一測多評法的復方丹參片質(zhì)量評價研究

廖曉虎，潘其麟，王曉曉，邱棟樑，李祥蘭，李茂森

(德陽市食品藥品安全檢驗檢測中心，四川 德陽 618000)

復方丹參片由丹參、三七和冰片三味中藥組成，具有活血化瘀、理氣止痛的功效，可用于治療氣滯血瘀所致的胸痹、冠心病和心絞痛等疾病[1，2]。2015年版《中國藥典》以丹參酮IIA、丹酚酸B、三七總皂苷(人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re和三七皂苷R1的總量計)作為復方丹參片的質(zhì)量控制指標[1]。丹參作為復方丹參片的君藥，來源于唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根及根莖[3]，以丹參酮類為代表的脂溶性成分是其主要有效成分，具有廣泛的藥理活性，根據(jù)其不同的化學結(jié)構(gòu)分為丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等[4，5]；復方丹參片中此類成分主要發(fā)揮保護心肌細胞免受心肌缺血再灌注損傷，改善心臟功能，促進梗塞后心肌重構(gòu)等作用[9-11]。

中藥多成分的含量測定方法長期以來一直面臨著對照品、生產(chǎn)品分離難度大，單體不穩(wěn)定，貨源緊缺，價格昂貴等問題。一測多評法通過建立樣品中某一易得、穩(wěn)定、有效的典型成分與其他成分間的相對校正因子(fi/s)以計算其他成分的量，實現(xiàn)了多成分的同步測定[6-8]。目前，《中國藥典》2015年版已將同步測定法用于丹參藥材、咳特靈膠囊等藥物的多成分測定。本研究將丹參酮類的代表成分丹參酮ⅡA、15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I作為研究對象，以丹參酮ⅡA為內(nèi)標，通過計算此成分與其余3個成分(15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I)間的相對校正因子，建立復方丹參片一測多評的方法，對復方丹參片進行質(zhì)量評價。并運用統(tǒng)計學方法進行相關(guān)性分析，以期為復方丹參片的質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與材料

UltiMate 3000型超高效液相色譜儀(美國)；Agilent 1260型超高效液相色譜儀(美國)；島津LC-2030液相色譜儀(日本)；METTLER TOLEDO XS205型電子天平(美國)；KQ-700DV型雙頻數(shù)控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

色譜柱：TechMate C18-ST柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

15，16-二氫丹參酮I(批號：00020044-611)對照品由美國ChromaDex提供；隱丹參酮(批號為 110852-201807，質(zhì)量分數(shù)為99.0%)、丹參酮I(批號為110867-201607)和丹參酮IIA(批號為110766-201721，質(zhì)量分數(shù)為99.5%)對照品，均購自中國食品藥品檢定研究院。

乙腈、甲醇均為色譜純；乙醇、磷酸均為分析純；超純水由ULUP-IV-10T型超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)制備。103批次復方丹參片樣品均來自2018年四川省食品藥品監(jiān)督管理局藥品評價性抽樣，見表1。

2 方法

2.1 色譜條件

以Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)為色譜柱；流動相A為乙腈，流動相B為0.02%磷酸，梯度洗脫(0～6 min，61% A；6～20 min，61%A～90% A；20～20.5 min，90% A～61%A；20.5～25 min，61% A)。流速1.0 mL/min；柱溫20 ℃；進樣量10 μL；檢測波長270 nm。在上述色譜條件下，4種成分的色譜峰分離度良好，見圖1。

注：1為15，16-二氫丹參酮I；2隱丹參酮；3丹參酮I；4丹參酮IIA

續(xù)表1 復方丹參片樣品信息與外標法和一測多評測定丹參酮類成分的含量及綜合得分 (mg·g-1)

2.2 對照品溶液的制備及線性范圍考察

分別取15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA對照品各適量，精密稱定，置同一100 mL量瓶中；加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品貯備液。分別精密吸取混合對照品儲備液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到這4種對照品的7個不同濃度的混合對照溶液。按擬定方法注入高效液相色譜儀，以峰面積和對應濃度(μg·mL-1)進行線性回歸，得到各個成分的回歸方程。結(jié)果顯示，這4個成分在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見表2。

表2 藥效成分的線性回歸方程

2.3 供試液的制備

取復方丹參片10片(糖衣片除去糖衣)，研成細粉，取細粉約1 g，精密稱定，置于150 mL錐形瓶中，準確加入25 mL甲醇，稱重，超聲(100 W，45 kHz)15 min，放冷，補足失重。0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度考察 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6針，測定這4種藥效成分的峰面積。15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的RSD均≤0.47%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 重復性考察 取同一樣品的粉末，6份，按“2.3”項下方法制備成供試品溶液，測定這4種藥效成分的峰面積，并計算其含量。15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量的RSD均≤0.87%，表明方法的重復性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取1份供試品溶液，于制樣后0、2、4、8、12、24、48 h按擬定方法進樣，結(jié)果15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA峰面積的RSD分別為1.56%、0.97%、1.08%、0.62%(n= 7)。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 回收率考察 精密稱取0.5 g已知這4種藥效成分含量的復方丹參片粉末6份，分別加入與樣品中這些藥效成分含量大致相當?shù)膶φ掌焚A備液，再按“2.3”項方法制備成供試品溶液，進樣測定。15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的平均回收率分別為106.14%、101.47%、98.29%、102.08%(n=6)，其RSD分別為4.06%、1.30%、1.24%、2.03%，表明所建立的方法準確性良好。

2.5 樣品含量的測定

稱取每份復方丹參片樣品的粉末2份，按“2.3”項方法制備供試品溶液，再按“2.1”色譜條件測定這4種藥效成分的峰面積。根據(jù)回歸方程計算這4種藥效成分在供試品中的含量(mg·g-1)，結(jié)果見表1。

3 結(jié)果與討論

3.1 一測多評質(zhì)量評價模式的建立

3.1.1 相對校正因子的計算 目前，對fi/s的計算多采用多點校正法和斜率校正法，這2種算法在計算過程中略有差異。多點校正法通過公式fi/s=(Ai/Ci)/(As/Cs)計算各成分的fi/s，式中Ai為待測成分i的峰面積，As為內(nèi)參物s的峰面積，Ci為待測成分的濃度或質(zhì)量，Cs為內(nèi)參物的濃度或質(zhì)量。樣品中待測成分量的計算公式為Ci′=Cs′Ai′/(fi/sAs′)，式中Ai′為樣品中待測成分i的峰面積，As′為樣品中內(nèi)參物s的峰面積，Ci′為樣品中待測成分i的濃度或質(zhì)量，Cs′為樣品中內(nèi)參物s的濃度或質(zhì)量[6]。在待測成分標準曲線A=aC+b中，采用斜率校正法計算fi/s，公式為fi/s=ai/as，式中ai為待測成分i斜率，as為內(nèi)參物s斜率。樣品中待測成分量的計算公式為Ci′=Ai′/(fi/sas)，式中Ai′為樣品中待測成分i的峰面積，Ci′為樣品中待測成分i的質(zhì)量[7，8]。

本實驗以丹參酮IIA為內(nèi)參物，比較了在島津LC-2030色譜儀與waters Symmetry C18色譜柱條件下2種不同算法對fi/s的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種算法計算結(jié)果無顯著性差異，見表3。考慮到斜率校正無需逐個濃度計算平均fi/s，且在樣品指標成分量計算過程中更為簡便，因此，在后續(xù)實驗中采用斜率校正法建立的fi/s進行計算。

表3 不同計算方法得到的fi/s

3.1.2 校正因子耐用性考察 本研究考察了Aglient 1260、UltiMate 3000和島津LC-2030這3種不同高效液相色譜系統(tǒng)和3種不同品牌、同類填料的色譜柱TechMate C18-ST柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)、Waters Symmetry C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)、Ultimate XB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，結(jié)果見表4、表5。RSD均小于3.0%，說明不同色譜柱對待測成分校正因子無顯著影響；相對校正因子在使用不同儀器時的耐用性較好。

表4 不同色譜系統(tǒng)下3個藥效成分的相對校正因子

此外，本研究還采用島津LC-2030高效液相色譜系統(tǒng)，Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，分別考察了不同流速(0.9、1.0、1.1 mL·min-1)和不同柱溫(18 ℃、20 ℃、22 ℃)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表6、表7。RSD≤2.0%，說明流速和柱溫微小變化時，校正因子波動較小，說明相對校正因子的重現(xiàn)性良好。

表5 不同色譜柱3個藥效成分的相對校正因子

表6 不同體積流量對3個藥效成分的相對校正因子的影響

注：3個藥效成分分別相對于內(nèi)參物丹參酮IIA的校正因子。

表7 不同柱溫對3個藥效成分的相對校正因子的影響

注：3個藥效成分分別相對于內(nèi)參物丹參酮IIA的校正因子。

3.1.3 一測多評法待測色譜峰的定位 為了在僅采用丹參酮IIA為對照品時，能夠確認丹參酮I、隱丹參酮和15，16-二氫丹參酮I色譜峰的位置，從而通過獲得的相對校正因子同時計算3種成分的量，達到一測多評的目的，本研究考察了采用不同儀器和色譜柱時丹參酮I、隱丹參酮和15，16-二氫丹參酮I色譜峰與丹參酮IIA色譜峰間的保留時間差和相對保留時間2個參數(shù)，結(jié)果見表8、表9。結(jié)果表明，其他待測成分與丹參酮IIA保留時間差的RSD在4.6%～9.5%之間，相對保留值的RSD在1.4%～2.0%之間?？梢?，與丹參酮IIA色譜峰的保留時間差和相對保留時間均可作為其他3個待測成分色譜峰的定位參數(shù)，相對保留時間較保留時間差的變異更小，所以可以采用相對保留時間作為色譜峰的定位。

表8 保留時間差考察結(jié)果

表9 相對保留時間考察結(jié)果

3.1.4 內(nèi)參物的選擇 以外標法的測定結(jié)果(Ws)為標準，評價一測多評法計算結(jié)果(Wf)的準確性。試以15，16-二氫丹參酮I為內(nèi)參物，Ws/Wf在42.90% ～ 122.70%之間，各成分外標法與一測多評法結(jié)果差異顯著；而以丹參酮IIA為內(nèi)參物，Ws/Wf在95.70% ～ 101.70%之間，結(jié)果令人滿意。加之丹參酮IIA作為丹參中含量較高的主要有效成分，且對照品較其他成分容易得到，故在本研究中選用丹參酮IIA為內(nèi)參物。

3.1.5 一測多評法與外標法的比較 為了驗證所建立的一測多評方法的準確性，本研究比較外標法測定結(jié)果與一測多評法計算結(jié)果，見表1。結(jié)果表明，根據(jù)得到的校正因子計算103份復方丹參片樣品中4個藥效成分的含量和外標法計算得到的4個藥效成分的含量之間的RE(相對誤差)值均<5%，并且配對t檢驗分析結(jié)果表明同一成分分別用兩種方法測定的含量之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。此外，采用外標法與一測多評法所得含量的比值(Ws/Wf)評價一測多評法的準確度，比值為95.70% ～ 101.70%，說明建立以丹參酮IIA為內(nèi)參物的一測多評法的準確度與外標法相當。

3.2 復方丹參片的質(zhì)量評價

以丹參酮IIA為參照成分，一測多評法計算103份復方丹參片樣品中4種丹參酮類的含量，15，16-二氫丹參酮I含量為0.079～0.809 mg·g-1，平均值0.325 mg·g-1；隱丹參酮含量為0.307～2.017 mg·g-1，平均值為0.814 mg·g-1；丹參酮I的含量為0.229～3.138 mg·g-1，平均值為0.814 mg·g-1；丹參酮IIA的含量為0.620 ～2.982 mg·g-1，平均值為1.116 mg·g-1，4種丹參酮成分的總量(總丹參酮)為1.493～8.459 mg·g-1，平均值3.226 mg·g-1。結(jié)果可見，不同生產(chǎn)企業(yè)、批號復方丹參片的丹參酮類的含量參差不齊，說明市面上的復方丹參片存在質(zhì)量差異，這可能與原藥材的質(zhì)量、生產(chǎn)工藝等有關(guān)。丹參藥材的產(chǎn)地、采收、加工、炮制等對丹參酮類成分的影響較大，以四川中江、遼寧凌源和山東平邑所產(chǎn)的丹參中丹參酮含量最高；以3年生并且在10-11月采收的丹參中丹參酮類的含量較高；陰干及低溫烘干法(40～60 ℃)較曬干法有利于丹參酮的保留；“發(fā)汗”能提高丹參酮類的含量；丹參藥材直徑越細，丹參酮類的含量越高；丹參酒炙，15，16-二氫丹參酮I、丹參酮IIA和丹參酮I的含量升高，隱丹參酮含量降低。在生產(chǎn)工藝方面，丹參提取物的提取時間、提取溶劑和濃縮溫度都會影響丹參酮的含量[12-16]。

3.3 主成分分析與曲線估計

把103批復方丹參片的15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量數(shù)據(jù)輸入SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件，設置提取因子數(shù)目為4，進行主成分分析，得到4個主成分得分變量(F1、F2、F3、F4)。4個主成分的貢獻率分別為63.614%、25.002%、7.862%和3.522%，以各主成分因子得分與對應方差貢獻率的乘積之和計算各個體的綜合模型函數(shù)。表達式C有效成分= 0.63614F1+ 0.25002F2+0.07862F3+ 0.03522F4，計算得到每份復方丹參片樣品的綜合得分值，詳見表1。

研究15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA、總丹參酮與綜合指標之間的關(guān)系有可能不是簡單的線性關(guān)系，為此，本研究選擇多種曲線模型對15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、總丹參酮與綜合指標之間的關(guān)系進行初步估計。在SPSS22.0軟件中選擇曲線估計，以主成分分析的綜合得分值為因變量，15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、總丹參酮分別為自變量，選擇線性、對數(shù)、倒數(shù)、二次、三次、復合、冪、S、增長、增長、指數(shù)、Logistic 12種曲線擬合模型進行曲線估計。模型R2值越大，表示模型估計越準確。結(jié)果表明，15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮總和的擬合效果，均通過可靠性檢查(P< 0.01)。在12種曲線擬合模型中(圖2)，有效成分均為二次、三次方程的擬合效果最好；另外，丹參酮IIA的線性擬合效果也好，見表10。根據(jù)以上結(jié)果可知，15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、總丹參酮與主成分分析的綜合得分值呈正相關(guān)，并且總丹參酮的擬合效果最好，相關(guān)性最強。

注：a、b、c、d、e、f分別為15，16二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮總和與綜合指標的12種擬合曲線

表10 15，16-二氫丹參酮I、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮總和與綜合指標的曲線估計

丹參酮類具有顯著的心腦血管保護作用和抗腫瘤作用及抗菌、抗炎等多種藥理作用[4]。丹參酮IIA是丹參酮類化合物最有代表性的有效成分，在心腦血管疾病方面具有很好的療效，主要用于治療局部缺血或動脈粥樣硬化疾病；15，16-二氫丹參酮I具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、保護肝臟的作用；隱丹參酮在抗腫瘤方面具有突出的作用；丹參酮I等具有神經(jīng)保護作用，可用于阿爾茨海默病的預防與治療[17-20]。說明這4種丹參酮類成分都有其特定的藥理作用。由于丹參酮中的成分復雜，不同成分之間也可能會存在相互作用。在體內(nèi)代謝過程中，丹參酮具有協(xié)同作用和代謝轉(zhuǎn)化作用。丹參酮提取物中的其他組分協(xié)同促進丹參酮IIA在動物體內(nèi)的吸收，同時促進隱丹參酮代謝轉(zhuǎn)化為丹參酮IIA；丹參酮IIA在大鼠體內(nèi)可代謝產(chǎn)生丹參酮IIB[21-22]。

從多指標的評價角度出發(fā)，總丹參酮與綜合指標的一致性較好，相關(guān)性最強，說明單一的丹參酮IIA或隱丹參酮含量還是難以反映復方丹參片的質(zhì)量，而以總丹參酮最好。提示我們需要從整體的角度出發(fā)，研究各個指標之間的相關(guān)性，才能更好地明確復方丹參片的藥效基礎，更好地為質(zhì)量評價服務。

4 結(jié)論

本研究利用丹參酮類成分化學結(jié)構(gòu)的相似性，建立了以1種成分為參照計算復方丹參片中4種丹參酮成分含量的一測多評法。采用方差分析，結(jié)果表明所建立的復方丹參片丹參酮類的一測多評含量測定方法與外標法的測定結(jié)果無顯著性差異。本研究采用校正因子法從量上闡明了復方丹參片中丹參酮類成分間的相互關(guān)系，建立的相對校正因子具有較好的可信度，方法簡單、快速、準確，可以實現(xiàn)在缺少對照品的情況下對復方丹參片丹參酮類成分的含量測定。

本研究運用統(tǒng)計學中的主成分分析及曲線估計法對丹參酮類的含量與復方丹參片的質(zhì)量進行相關(guān)性分析?？偟⑼c主成分分析的綜合得分值呈正相關(guān)，并且總丹參酮的擬合效果最好，相關(guān)性最強。