非洲豬瘟國內(nèi)流行現(xiàn)狀及診斷、防控

周仁江 楊治聰 黃先奇 沈愛梅 葉鵬 曹昕 郭莉 侯巍 陽愛國 莫茜 尹杰 袁東波 魯志平 郭萬里 曾子鑫

非洲豬瘟國內(nèi)流行現(xiàn)狀及診斷、防控

周仁江①楊治聰①黃先奇②沈愛梅②葉鵬②曹昕②郭莉③侯?、坳枑蹏勰纰垡堍墼瑬|波③魯志平④郭萬里⑤曾子鑫⑥

（①四川省青神縣動物疫病預防控制中心 620460 ②四川省眉山市動物疫病預防控制中心 ③四川省動物疫病預防控制中心 四川 成都 ④成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院 四川 成都 ⑤四川省茂縣動物疫病預防控制中心 ⑥四川省南充市嘉陵區(qū)動物疫病預防控制中心）

非洲豬瘟(African swine fever, 簡稱ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起豬的一種急性、高度致死性傳染病。自2018 年8 月中國首例非洲豬瘟案例以來，短短數(shù)月，已席卷了全國31個省份，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，形勢異常嚴峻，因此開展非洲豬瘟診斷工作、病毒基礎研究工作至關重要。本文分析了非洲豬瘟流行現(xiàn)狀，并綜述了研究學者在非洲豬瘟各種診斷技術、病毒基礎研究、綜合防控等方面的研究進展，對加強我國非洲豬瘟診斷技術的儲備與制定非洲豬瘟防控措施提供參考。

ASF臨床上以豬高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟實質(zhì)器官出血、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主要特征，易感豬群的病死率高達100%。是一種嚴重的“世界經(jīng)濟”動物疫病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告動物疫病，在我國被列為一類動物疫病。ASFV不感染人，對人的健康不構成威脅。目前，針對ASF防控，尚無有效的商品化疫苗和治療方法。

1 ASF流行與危害

2018年8月3號，中國動物衛(wèi)生與流行病學中心診斷首次報道我國出現(xiàn)非洲豬瘟病例，截至今年8月26日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部通報通報疫情152起，涉及全國31個省(市、區(qū))，其中野豬3起，家豬149起；共解除封鎖148起，解除疫情省份28個；今年將近7個月的時間里，發(fā)生疫情53起。

表1 全國非洲豬瘟疫情形勢

2 病原學特征

2.1 基因組龐大，易變異

非洲豬瘟病毒(ASFV)，屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，雙股DNA，是唯一核酸為DNA的蟲媒病毒，基因組長度約為170~193kb，是藍耳病病毒的12倍，豬瘟病毒的15倍，口蹄疫病毒的24倍。其中基因組結構主要包含約125kb的中央保守區(qū)、38~47kb的左側可變區(qū)和13~16kb的右側可變區(qū)，基因組變異非常頻繁，根據(jù)B646L基因的相似性，可以將ASFV分成24個不同的基因型，進一步根據(jù)P54和PB602L基因的中央可變區(qū)(CVR)序列，ASFV 的分型數(shù)量會更多。

附圖 基于ASFV B646L 基因的 24個基因型

2.2 存活時間長，抵抗力強

ASFV個體較大，直徑200nm，表面為正二十面體和一層含類脂囊膜的對稱結構病毒，因此高溫和一些破壞囊膜的消毒劑均可有效殺滅ASFV。但是由于其復雜的分子結構，ASFV對消毒劑的抵抗力較其他的囊膜病毒稍強，特別是在一些豬肉制品或血液中存活時間更長。在血液、糞便和組織中可長期存活，凍肉中存活數(shù)年甚至數(shù)十年。廣東省首例非洲豬瘟，疫點消毒7d后環(huán)境樣品仍然能檢測到病毒核酸。

表2 ASFV與FMDV耐受性

3 ASF的診斷

目前尚無針對ASF有效的治療方法和疫苗，因此迫切需要快速的ASF檢測及防控技術，以及時發(fā)現(xiàn)ASFV感染豬并及時撲滅疫情。目前，ASFV的檢測技術主要有針對病毒DNA的核酸檢測技術和基于病毒抗體反應的免疫學技術兩大類。

3.1 ASF臨床癥狀和病理變化

臨床癥狀與病毒的毒力、感染的劑量和途徑有關，可分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。最急性型無明顯癥狀，突發(fā)高熱后迅速死亡。急性型、亞急性型的病理剖解變化較明顯，主要的病變器官為脾臟、淋巴結、腎臟和心臟。脾臟顯著腫大(一般情況下是正常脾的3~6倍，顏色變暗，質(zhì)地變脆，脾臟的變化是一種典型的病理變化)；淋巴結腫大、出血、變脆，有時血腫呈黑紅色，切面呈大理石樣；腎皮質(zhì)和腎盂切面有點狀出血；心臟斑點狀出血，心包積液帶有血液。慢性型主要發(fā)生于非洲野豬，感染豬幾無臨床癥狀。

3.2 血清學檢測方法

3.2.1 紅細胞吸附試驗 HAD是ASF的確診方法之一，通過用豬的血液或組織懸液接種原代白細胞培養(yǎng)物或制備感染豬血液白細胞培養(yǎng)物完成相應檢測，鏡檢出現(xiàn)紅細胞吸附在感染細胞的表面，呈現(xiàn)玫瑰花環(huán)或桑葚狀現(xiàn)象，可判定為陽性。HAD需要觀察的時間取決于病料中病毒的含量，通常需要3~10ｄ，有個別ASFV毒株沒有紅細胞吸附能力，因此目前逐步被PCR所代替。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 目前國內(nèi)外常用作檢測抗原的蛋白有VP73、VP72、P54等。ASFV感染豬7d左右即可檢出IgM和IgG，并且IgG在感染豬體內(nèi)能存在數(shù)年。目前以VP73蛋白、VP72蛋白、P54蛋白的商品化ELISA試劑盒被廣泛應用，抗體檢測試劑盒有ASF阻斷ELISA試劑盒(Ingenasa，西班牙)等，抗原檢測試劑盒有ELISA EZIM K3試劑盒(Ingenasa，西班牙)。

3.2.3 膠體金免疫層析(GICA)試紙條 膠體金免疫層析技術是適合基層現(xiàn)場快速診斷和流行病學調(diào)查的一項檢測技術。張鑫宇等原核表達Ｐ54重組蛋白，制作ASFV P54抗體檢測膠體金免疫層析試紙，具有特異性強、敏感性高等特點。劉波(2014)也運用原核表達系統(tǒng)和膠體金免疫層析技術，對ASFV快速檢測試紙條的技術進行了研究。吳海濤(2018)運用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標抗體，制備了用于檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條。

3.2.4 其他血清學方法 熒光抗體試驗(FAT)可以用作ASFV抗原檢測的一種輔助方法，可用于檢測野外可疑豬或實驗室接種豬的脾、淋巴結等組織中的抗原，也可以鑒定無紅細胞吸附能力的毒株。該方法具有快速、經(jīng)濟、敏感性和特異性高等優(yōu)點，但需要專業(yè)試驗人員，同時需要熒光顯微鏡及高質(zhì)量的熒光標記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測方法。間接免疫熒光試驗(IFA) 可用于檢測感染ASFV的豬血清樣品。該方法的優(yōu)點是當ELISA檢測結果不確定或制備抗原困難或復雜時，可選用此法。免疫組化法是通用的檢測方法之一，但對于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度，因此，該方法僅作為ASFV的輔助檢測方法。免疫印跡檢測(immuno-blotting test)是將蛋白質(zhì)電泳技術與血清學相結合的一種免疫生化技術，該方法特異性高，能簡單客觀的判定結果，能識別出弱陽性結果，可作為IFA替代方案對個別不確定結果進行確證。

3.3 分子生物學檢測方法

3.3.1 聚合酶鏈式反應(PCR) PCR具有簡單快速、靈敏度高和特異性強的優(yōu)點，是目前ASFV最常用的實驗室檢測方法。Aguero等(2003)和曾少靈等(2009)先后根據(jù)ASFV VP72基因建立了ASFV的PCR檢測方法，均具有良好的敏感性和特異性，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學檢測方法。崔尚金等(2012)建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法，采用納米金顆粒作為熱導介子，提高了PCR反應效率。

3.3.2 熒光定量PCR 實時熒光定量PCR比常規(guī) PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時快速檢測大批量樣品。Fernandez等(2013)利用通用探針庫建立了ASFV的實時熒光定量PCR方法。王建華等(2016)根據(jù)ASFV CP530R基因和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2基因為靶序列，建立了可同時鑒別檢測ASFV和PRRSV的二重TaqMan熒光定量RT-PCR方法。崔貝貝等(2019)根據(jù)E184L基因建立了快速檢測ASFV的TaqMan熒光定量PCR方法，方法能快速、準確、特異、靈敏地對ASFV核酸進行定量分析，且與偽狂犬病病毒、豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒２型等多種病原不存在交叉反應。

3.3.3 重組酶聚合酶擴增(RPA)技術 RPA是一種可以替代傳統(tǒng)PCR的新型核酸檢測技術，該方法操作簡單、反應快速、檢測成本低、結果確實可靠。王建昌等(2016)基于ASFV VP72基因保守序列設計并合成引物，建立了ASFV RPA等溫檢測方法，為ASFV的一線防控提供了一種新的、可靠的技術支持。吳映彤等(2018)基于ASFV多基因家族成員MGF360-12L基因序列，建立重組酶聚合酶擴增(RPA)等溫檢測方法，該方法操作簡單、反應快速、檢測成本低，為ASFV相關基因缺失毒株的鑒別診斷提供一定技術支持。

3.3.4 線性指數(shù)聚合酶鏈式反應(LATE-PCR)技術 LATE-PCR是不對稱PCR的一種形式，該方法用于檢測組織樣品的病毒，其敏感性可以達到大約1拷貝的病毒DNA。Ronish等(2011)基于ASFV VP72基因建立了LATE-PCR方法，為ASFV的實驗室診斷提供了敏感的檢測方法。

3.3.5 環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)技術 LAMP 技術操作簡單、靈敏、快速，檢測成本遠低于熒光定量PCR，且不需要特殊儀器設備，具有較高的臨床實用性。JAMES等針對ASFV拓撲異構酶Ⅱ基因建立了一步法檢測ASFV的LAMPs方法，最低可以檢測到330拷貝DNA的病毒。國內(nèi)學者均根據(jù)ASFV Ｐ72基因建立了ASF LAMPs檢測方法，特異性良好，與常規(guī)PCR比靈敏度高，可用于ASF快速檢測。鄔旭龍(2014)根據(jù)ASFV K205R基因序列設計引物，建立了LAMP檢測方法。

3.3.6 探針雜交技術 張鑫宇等(2011)針對ASFV VP72基因建立了納米金探針雜交方法。探針雜交技術檢測靈敏度高，能有效排除PCR檢測過程中的非特異性結果，省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡便、檢測迅速，在酶標板中可批量反應，為ASFV核酸檢測方法開辟了新的途徑，但該方法的建立難度較高、操作較繁瑣，對試驗人員技術水平要求較高。

3.3.7 原位雜交 原位雜交(insituhybridization，ISH)是將標記的核酸探針與組織細胞中待檢核酸特異結合，再用檢測系統(tǒng)檢測標記探針，同時顯示核酸所在的位置。BALLESTER等使用ISH技術，用地高辛標記的探針檢測福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的ASFV DNA，并取得較好的檢測效果。

4 ASF的防控

4.1 政府應充分發(fā)揮自身主導作用，強制落實有效的ASF防控政策

4.1.1 向社會公眾普及ASF危害性，動員公眾參與到ASF疫情防控中 做好ASF的社會科普工作，向全社會普及其危害，重點做好農(nóng)村宣傳工作，及時且合理的補貼生豬養(yǎng)殖者的損失，引導生豬養(yǎng)殖經(jīng)營等重點環(huán)節(jié)從業(yè)者積極主動參與到ASF防控行動中，形成全民參與的ASF防控統(tǒng)一戰(zhàn)線。

4.1.2 加大ASF疫情防控技術投入與創(chuàng)新，為ASF防控提供的技術支持 ASF疫情防控技術主要包括快速診斷、防控技術、疫苗研究等。由于非洲豬瘟病毒擁有龐大的基因組結構和復雜的免疫逃逸機制，使得目前全世界范圍內(nèi)尚無商品化安全有效的疫苗。專業(yè)領域的科研機構，要發(fā)揮科技人才優(yōu)勢，把疫苗研發(fā)作為戰(zhàn)略性科技攻關項目來推動，力爭盡早取得突破，為我國ASF疫情的有效防控提供重要科學依據(jù)，為檢測技術和防治疫苗研發(fā)奠定了重要基礎。

4.2 生豬養(yǎng)殖經(jīng)營等重點環(huán)節(jié)從業(yè)者應發(fā)揮自身主體作用，積極配合政府的防疫工作

4.2.1 生豬養(yǎng)殖場(戶)積極配合政府的疫情管理工作，做好豬場生物安全制度 養(yǎng)殖場(戶)應積極配合政府的疫情管理工作，主動了解ASF防控知識，提高對ASF疫情的甄別能力與應急能力。目前，豬場生物安全已成為養(yǎng)殖場(戶)存活的關鍵所在，也是豬場防控非洲豬瘟唯一措施。按規(guī)定申報檢疫，減少場外人員和車輛進入豬場，重點是做好豬群飼養(yǎng)管理，對豬群實施全進全出飼養(yǎng)管理，不散放飼養(yǎng)，避免家豬與野豬接觸，提高飼養(yǎng)的生物安全水平。同時堅決不使用泔水或餐廚垃圾喂豬，切斷飼養(yǎng)過程中一切可能的疫情傳播途徑，積極配合獸醫(yī)人員做好每日排查工作。

4.2.2 生豬經(jīng)營重點環(huán)節(jié)從業(yè)者，不進行違法生豬交易行為 我國新聞報道已頻繁揭露了許多不法分子“洗豬”、“炒豬”等違法交易行為，違法經(jīng)營行為直接造成了染疫豬只及產(chǎn)品在全國各地的流通，加速了ASF在我國的擴散。生豬養(yǎng)殖、運銷、屠宰、市場等重點環(huán)節(jié)從業(yè)人員應加強動物防疫法律的學習，樹立動物防疫法律意識，遵守法律對生豬行業(yè)從業(yè)人員的規(guī)定與要求，時刻用不法分子承受的嚴重代價來警醒自己，發(fā)現(xiàn)可疑情況及時上報，不要隱瞞疫情，不給生豬交易過程中的人員創(chuàng)造違規(guī)操作的空間。

5 小結

（1）ASF作為一種重要的動物疫病，其病原結構和流行病學復雜，具有傳染性強、死亡率高、缺少有效的疫苗預防等特征。在我國的《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020)》中，ASF被列為優(yōu)先防范的13種重大外來動物疫病之一。從2018年8月3日以來，我國已有31個省(市、區(qū))相繼發(fā)生該疫情，目前非洲豬瘟疫情對我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重威脅。因此，開展對ASF的相關研究，尤其是病原學、流行病學、診斷技術和疫苗等，將為ASF的防控奠定理論基礎。（2）ASFV的實驗室檢測方法多種多樣，各有優(yōu)缺點，但對各種方法的檢測結果均要求準確、快速、敏感，這不僅對感染ASFV的動物治療非常重要，而且對未感染的動物及時采取有效的預防措施同樣具有重要的意義。OIE推薦檢測方法主要有PCR、實時熒光定量PCR、ELISA等。用免疫學方法檢測抗體可以了解ASFV感染、發(fā)生、發(fā)展的進程，但抗體只有在病毒感染至一定時期后才會出現(xiàn)，故ELISA等抗體檢測方法在病毒早期監(jiān)測工作中存在一定的局限性。PCR、實時熒光定量PCR、LAMP 等分子生物學技術在豬感染ASFV的早期即可檢測到病毒核酸，在早期檢測中具有重要作用。目前，動物疫病預防控制機構多采用經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準、由青島立見診斷技術發(fā)展中心生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑。（3）過去的幾十年中，ASFV疫苗的研究雖取得了較大進展，包括評估細胞傳代致弱、自然致弱、基因缺失等ASFV疫苗，但是暫時都還未研制出可應用于實際生產(chǎn)的疫苗。通過基因重組技術，獲得安全、高效ASFV減毒活疫苗仍是ASFV疫苗開發(fā)的首選策略。然而，仍有一些問題需要考慮，主要包括疫苗產(chǎn)生具備中和ASFV抗體，在體內(nèi)的安全性研究，鑒別野毒感染和疫苗免疫，以及鑒定并開發(fā)適合弱毒活疫苗生產(chǎn)的細胞系等。今年4月，哈爾濱獸醫(yī)研究所申請了基因缺失的減毒非洲豬瘟病毒及其作為疫苗的應用專利，但安全有效的疫苗要從實驗室研究到大規(guī)模商業(yè)化量產(chǎn)，還有很長一段路要走。（4）ASF的暴發(fā)對我國養(yǎng)殖業(yè)既是空前的挑戰(zhàn)，又將對我國養(yǎng)豬業(yè)及相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生深遠的影響。截至2019年7月3日，中國31 個省(市、區(qū))共發(fā)生143起ASF疫情，據(jù)報道大約有116萬余頭豬被撲殺以阻止疫情的傳播。ASF疫情勢必打擊部分養(yǎng)豬從業(yè)者的養(yǎng)殖信心和補欄意愿，但對于重塑我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)格局、重新布局養(yǎng)豬業(yè)區(qū)域、改變現(xiàn)有落后的養(yǎng)豬模式、提高養(yǎng)殖戶生物安全意識、終結泔水養(yǎng)豬、升級生豬調(diào)運裝備等都有積極的推動作用。

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（2019–09–09）

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