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      番茄灰葉斑病抗性鑒定方法及抗病種質(zhì)資源篩選

      2019-12-24 09:45:28徐成翠張瑤瑤鄭積榮張敬澤盧鋼
      浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年12期
      關(guān)鍵詞:葉斑病離體活體

      徐成翠,張瑤瑤,鄭積榮,張敬澤,盧鋼*

      (1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州 310058; 2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310024)

      番茄(LycopersiconesculentumMill.)為茄科一年生草本植物[1],原產(chǎn)于南美洲,在我國廣泛栽培,是中國最重要的蔬菜之一。番茄灰葉斑病是番茄的一種重要病害,病原為茄葡柄霉(Stemphyliumspp.),屬半知菌亞門葡柄霉屬真菌,該病菌主要危害葉片,環(huán)境條件適宜時(shí),還危害莖稈和果實(shí),為害嚴(yán)重時(shí),導(dǎo)致全部葉片變黃,被侵染的葉片逐漸變褐枯萎并從植株上脫落?;胰~斑病可導(dǎo)致番茄減產(chǎn)20%~80%,同時(shí)造成番茄果實(shí)質(zhì)量下降[2]。另外近年來受到番茄黃化曲葉病毒病的影響,很多地區(qū)都種植了抗病毒病品種,田間種植表明這些品種對(duì)真菌性病害尤其是灰葉斑病的抵抗能力較低,所以灰葉斑病已經(jīng)成為我國冬春季番茄的主要病害之一,給番茄生產(chǎn)帶來了不可低估的影響。

      在適宜條件下,番茄灰葉斑病傳播極快,從發(fā)病到全株葉片感染只需2~3 d,利用化學(xué)防治難度較大,所以培育抗病品種是防治灰葉斑病既經(jīng)濟(jì)、有效又安全的措施。在番茄育種中對(duì)病原菌抗性鑒定和番茄抗源的篩選尤為重要,而鑒定方法的選用又是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文從分離番茄灰葉斑病病原菌入手,建立早期抗性快速鑒定方法,并利用該方法對(duì)81份國內(nèi)外引進(jìn)的抗性種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定篩選,為番茄抗灰葉斑病品種選育奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      番茄品種Micro-Tom、TH1353等用于比較不同抗病性鑒定技術(shù),從國內(nèi)外廣泛引進(jìn)的78份番茄育種材料及3份雜交組合用于抗性資源鑒定。以上材料均由浙江大學(xué)蔬菜研究所番茄課題組繁殖保存。

      番茄種子先用紗布包好,于55 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸種15 min,然后在常溫下浸泡4 h,取出置于28 ℃恒溫箱內(nèi)保濕催芽3 d直至種子露白,最后播于穴盤中(基質(zhì)配比為草炭土∶蛭石∶珍珠巖為3∶2∶1),光、暗培養(yǎng)周期為16 h 28 ℃/8 h 23 ℃,光照強(qiáng)度為300 μmol·m-2·s-1。

      1.2 病原菌分離和鑒定

      1.2.1 病原菌的分離

      從浙江省杭州蔬菜研究所大棚發(fā)病植株上采集具有典型癥狀的病葉,用于病原菌的分離。

      組織分離法分離病原菌。剪取1 cm2見方的病健交界處有明顯病征的病葉,在10%NaClO中消毒3 min,無菌水漂洗3次,于無菌濾紙上晾干,擺放于PDA培養(yǎng)基上,置(25±2)℃黑暗中培養(yǎng)出菌落,取1 cm2見方菌塊置于新PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)[3]。

      直接分離病原菌。用鑷子刮取少量表面物于無菌水中混勻,均勻涂抹在有網(wǎng)格狀標(biāo)記的瓊脂板培養(yǎng)基上,在顯微鏡下挑取茄匐柄霉單胞存在的培養(yǎng)基方格,置于PDA培養(yǎng)基上,在(25±2)℃,12 h/12 h光暗下培養(yǎng),再進(jìn)行純化培養(yǎng)。

      1.2.2 病原菌鑒定

      病原菌孢子的鑒定。將純化菌種轉(zhuǎn)到PDA培養(yǎng)基上,在黑光燈照射和黑暗交替條件下培養(yǎng)產(chǎn)生孢子,在400倍顯微鏡下觀察。

      接種鑒定。將分離的病原菌孢子懸浮液的孢子濃度稀釋至100倍顯微鏡視野上40個(gè)孢子(約8×105孢子·mL-1),采用滴接法接種至番茄Micro-Tom葉片上,統(tǒng)計(jì)接種后葉片發(fā)病情況。采集發(fā)病的葉片進(jìn)行病原菌分離試驗(yàn),與病原菌的菌落進(jìn)行對(duì)比。

      1.3 番茄抗性鑒定方法比較

      1.3.1 離體接種和活體接種

      離體接種。不同番茄品種在溫室育苗,待長至4~5葉期剪取頂部向下第2~3葉片,流水沖洗后,無菌水沖洗3次,平鋪于預(yù)先鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿(9 cm×9 cm)中,采用涂抹法進(jìn)行接種,置于25 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng),接種后第6天調(diào)查。

      活體接種。對(duì)4~5葉期植株頂部向下第2~3葉片涂抹接種,控制相對(duì)濕度100%,溫度(25±2)℃,培養(yǎng)2 d后恢復(fù)正常培養(yǎng),接種后第10天調(diào)查,分別計(jì)算病情指數(shù)。

      1.3.2 噴霧和涂抹接種技術(shù)

      不同番茄品系在溫室育苗,待長至4~5葉期摘取植株頂部向下第2~3葉片進(jìn)行離體抗病性鑒定。接種所用番茄灰葉斑病孢子懸浮液濃度為100倍顯微鏡視野約15個(gè)孢子(約3×105孢子·mL-1)。

      噴霧接種。用噴壺將番茄灰葉斑病孢子懸浮液均勻噴霧于葉片至有水滴滴落,每片葉約接種0.2 mL。每個(gè)品系接種4株,重復(fù)3次。

      涂抹接種。用毛筆蘸取番茄灰葉斑病孢子懸浮液對(duì)選取的葉片涂抹,每片葉約接種0.2 mL。每處理4株8片葉,重復(fù)3次。接種后第6天根據(jù)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算病情指數(shù)。

      1.4 統(tǒng)計(jì)分析方法

      1.4.1 病情分級(jí)

      根據(jù)灰葉斑病接種后病葉發(fā)病程度,參照Cho等[4]致病力分級(jí)方法進(jìn)行分級(jí)調(diào)查。番茄灰葉斑病病情分為5級(jí):1級(jí),葉片上無癥狀;2級(jí),有黑色枯死點(diǎn),占葉面積10%以下;3級(jí),病斑面積占葉片面積的11%~20%;4級(jí),病斑占葉面積21%~50%;5級(jí),病斑占葉面積50%以上。

      1.4.2 病情指數(shù)及抗病評(píng)價(jià)體系

      病情指數(shù)=Σ[(該病級(jí)值×病級(jí)葉片數(shù))/(最高病級(jí)數(shù)×調(diào)查總?cè)~片數(shù))]×100%。

      抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[5-6]方法,分為免疫(I,不表現(xiàn)癥狀,病情指數(shù)為0)、高抗(HR,0 <病情指數(shù)≤1.5)、中抗(MR,1.5<病情指數(shù)≤5)、中感(MS,5<病情指數(shù)≤25)、感病(S,25<病情指數(shù)≤100),并將I、HR及MR歸為抗病,將MS和S歸為感病。

      1.5 番茄抗源的篩選

      從國內(nèi)外引進(jìn)78份番茄育種材料及3份雜交組合,共81份種質(zhì)資源用于抗性鑒定。當(dāng)番茄長至6~7葉期時(shí),利用涂抹法進(jìn)行離體接種鑒定,接種部位為頂端向下第2~3片真葉展開,每處理4株8片葉,重復(fù)3次。接種后保濕24 h,接種6 d后調(diào)查病情指數(shù)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 病原菌的鑒定

      通過顯微鏡觀察到,菌絲體初為白色,后漸呈暗褐色,以及清晰的病原菌孢子圖像,分生孢子多單生,倒短棒或橢圓形,頂端鈍圓、褐色、光滑,磚格狀分隔,一般有3個(gè)橫隔,1~3個(gè)縱隔膜,分生孢子大小為30~55 μm×13~25 μm。單胞茄匐柄霉菌培養(yǎng)時(shí)會(huì)有色素顯現(xiàn),為黃褐色至紅褐色。接種到番茄Micro-Tom葉片上,結(jié)果表現(xiàn)為灰葉斑病癥狀(圖1),證實(shí)所分離的病原菌為灰葉斑病致病菌。

      2.2 抗病性鑒定方法比較

      2.2.1 離體葉片與苗期活體接種法比較

      由表1可知,比較苗期活體接種和離體葉片接種體系的病情指數(shù)大小發(fā)現(xiàn),活體接種結(jié)果和離體接種結(jié)果基本一致。TY-1活體接種表現(xiàn)為高抗,離體接種表現(xiàn)為中抗;TY-25、T101F-201兩種接種方式下均表現(xiàn)為中抗;TY-11均表現(xiàn)為中感;但品系T101F-204在活體接種時(shí)表現(xiàn)為中感,在離體葉片接種時(shí)表現(xiàn)為感病。從4個(gè)品系的接種方法比較結(jié)果來看,離體接種后的病情指數(shù)比苗期活體接種平均增高1.3百分點(diǎn),而在T101F-204品系中,病情指數(shù)增高12.8百分點(diǎn),離體接種出現(xiàn)癥狀比活體接種更加明顯。2種接種方法的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.907 5,說明2種接種鑒定方法均可用于番茄灰葉斑病抗病性鑒定。

      圖1 番茄灰葉斑病病原孢子分離與鑒定

      表1 番茄苗期不同接種方法病情指數(shù)比較

      2.2.2 涂抹法與噴霧法比較

      由表2可知,2種接種方法均表現(xiàn)出噴霧法病情指數(shù)低于涂抹法,且涂抹法接種的品種間的病情指數(shù)差異更大,意味著對(duì)不同抗病性品種的區(qū)分度更高,且涂抹法不同重復(fù)間的標(biāo)準(zhǔn)誤更小,說明其更有利于減少操作誤差。

      表2 不同接種方法病情指數(shù)比較

      2.3 抗源篩選

      試驗(yàn)表明,不同番茄品系間灰葉斑病的抗性差異很大。有的品系所有葉片均發(fā)病且十分嚴(yán)重,幾乎整個(gè)葉片發(fā)黃褐化。但采用同樣方法接種病原菌,且在相同培養(yǎng)條件下,部分材料的葉片幾乎不發(fā)病,也觀察不到病原菌,不同品系之間葉片發(fā)病的病情指數(shù)差異巨大。表3顯示,在接種的81個(gè)番茄自交系或雜交組合中,LA3528、LA3911、LA2823、CLN2264G、LA1802、LS-1306F、LS-1313F等7份材料表現(xiàn)出較強(qiáng)的番茄灰葉斑病抗病性,尤其是LA3528和LA3911為野生番茄材料,對(duì)番茄灰葉斑病高抗。LA3528、LA3911、LA2823、LA4285、LA1802均來自于美國種質(zhì)資源庫,CLN2264G來自于亞蔬中心,LS-1313F和Ty-1101為項(xiàng)目組保存的兩個(gè)自交系。同時(shí)發(fā)現(xiàn),TY-1138、TY-1147、TY-1116、TY-1142、TY-1108、TY-1123、TY-1144、N9021、T010-51是易感材料,病情指數(shù)在44.7%~75.3%,而這些材料大多含有黃化曲葉病毒病抗性基因。

      3 小結(jié)與討論

      番茄抗病材料的鑒定與篩選是抗病育種過程中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。簡便易行的接種體系的建立對(duì)番茄抗病材料的鑒定與篩選極為重要。從活體接種和離體的接種結(jié)果來看,兩種接種方法的結(jié)果基本一致,說明兩種接種鑒定方法均可用于番茄抗灰葉斑病資源篩選、品種(系)抗性鑒定,對(duì)于珍貴材料或者在番茄材料比較少的情況下,可以采用離體葉片接種的方法對(duì)材料進(jìn)行抗性鑒定,簡化育種的工作及流程。另外接種結(jié)果顯示,離體接種出現(xiàn)的癥狀比活體接種更明顯,因而對(duì)于篩選到的抗病品種可以采用離體接種的方法進(jìn)一步高效地篩選出高抗品種。葉片離體接種時(shí)采用涂抹法對(duì)于驗(yàn)證品種間抗病性的區(qū)分度更高,且涂抹法接種均勻,相對(duì)于噴霧法更容易控制試驗(yàn)變量,減少由操作引起的試驗(yàn)誤差。

      接種試驗(yàn)共篩選出對(duì)灰葉斑病免疫的材料1份,高抗材料6份,中抗材料13份。感病品種的感病系數(shù)超過40%的極感病材料有13份,不同材料對(duì)番茄灰葉斑病的抗性差異明顯。同時(shí)發(fā)現(xiàn),雜交組合TY1101♀×LA2823♂與母本的抗病性表現(xiàn)一致,表現(xiàn)為中等抗性,可能父本的高抗基因?yàn)殡[性或者在細(xì)胞質(zhì)中遺傳。另外發(fā)現(xiàn),TY-1138、TY-1147、TY-1116等是易感材料,病情指數(shù)在44.7%~75.3%,這些材料大多含有黃化曲葉病毒病抗性基因。據(jù)報(bào)道,山東壽光地區(qū)大面積推廣抗黃化曲葉病毒(TYLCV)病番茄品種后番茄灰葉斑病呈現(xiàn)出暴發(fā)流行趨勢(shì)[7],劉國華[8]曾報(bào)道抗TYLCV的番茄品種灰葉斑病發(fā)病較重。目前在生產(chǎn)上推廣的抗TYLCV番茄品種,如迪芬尼、齊達(dá)利、迪利奧、金棚8號(hào)、金棚10號(hào)等均表現(xiàn)為對(duì)灰葉斑的感病性,且感病后發(fā)病速度快,影響番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量[7]。本研究的抗性鑒定進(jìn)一步證實(shí)了抗TYCLV品種大多容易發(fā)生灰葉斑病,對(duì)番茄的生產(chǎn)造成較大危害,因而從國外引進(jìn)推廣抗TYCLV番茄品種時(shí)應(yīng)注意防治灰葉斑病,注重引進(jìn)品種的本土適應(yīng)性,同時(shí)應(yīng)加快選育兼抗品種[9-10]。

      表3 番茄苗期活體接種灰葉斑病病原菌不同品種病情指數(shù)

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