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    粉塵螨1組主要變應(yīng)原(Der.f 1)含量測定體系比較

    2019-12-24 01:42:38影,魯旭,王斌,曾
    關(guān)鍵詞:變應(yīng)原塵螨制品

    張 影,魯 旭,王 斌,曾 明

    塵螨過敏是最常見的過敏性疾病,而屋塵螨(Dermatophagoidespteronyssinus)和粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)是導(dǎo)致塵螨過敏癥最常見的螨蟲物種,當(dāng)前的螨變應(yīng)原制品均是以屋塵螨和/或粉塵螨的純種培養(yǎng)物為原材料制備而成的[1-2]。螨變應(yīng)原制品成分復(fù)雜,屋塵螨和粉塵螨的1組和2組變應(yīng)原(Der.f1、Der.f2;Der.p1、Der.p2)是目前公認(rèn)的有效變應(yīng)原成分,并且至少60%的塵螨過敏患者對這兩種主要變應(yīng)原發(fā)生反應(yīng)[3-6]。有研究表明90%塵螨過敏患者的血清與Der.f1具有免疫反應(yīng),因此粉塵螨1組主要變應(yīng)原(Der.f1)是目前國際公認(rèn)的粉塵螨變應(yīng)原制品中的關(guān)鍵活性成分,且有研究認(rèn)為其含量直接關(guān)系到制品的總生物學(xué)效力[3]。

    目前各國研究機(jī)構(gòu)均采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay,sELISA)測定Der.f1含量,該檢測方法既需要Der.f1含量明確的抗原標(biāo)準(zhǔn)品,也需要適宜的Der.f1特異性的包被抗體和檢測抗體[7-10]。中國目前批準(zhǔn)上市的粉塵螨變應(yīng)原制品均須進(jìn)行Der.f1含量的測定,但是中國尚未建立相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)品,各企業(yè)Der.f1含量測定標(biāo)準(zhǔn)品及檢測用的抗體系統(tǒng)均不同,這種主要變應(yīng)原含量測定抗原及抗體系統(tǒng)多樣化的現(xiàn)狀增加了制品間質(zhì)量差異較大的風(fēng)險(xiǎn)。已有研究報(bào)道采用不同的主要變應(yīng)原含量測定體系測定同一種變應(yīng)原提取物中的主要變應(yīng)原,測定結(jié)果存在一定的差異[9]。為了探索統(tǒng)一抗原、抗體標(biāo)準(zhǔn)品,及檢定方法對主要變應(yīng)原Der.f1含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化測定是否具有可行性,本研究采用上述3種不同來源的Der.f1抗原標(biāo)準(zhǔn)品及特異性檢測抗體分別測定來自3家企業(yè)的粉塵螨變應(yīng)原制品中的Der.f1含量,比較這些檢測系統(tǒng)所測定結(jié)果的異同,探索建立Der.f1含量測定用抗原、抗體國家標(biāo)準(zhǔn)品是否具有可行性。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑及儀器

    酶標(biāo)儀,為MD公司產(chǎn)品。洗板機(jī),為Thermo公司產(chǎn)品。

    Der.f1含量測定用標(biāo)準(zhǔn)品分別來自A企業(yè)(ST-H011,Der.f1含量為6 μg/瓶),B企業(yè)(MS-14,Der.f1含量為73.2 μg /瓶),Indoor公司(EL-UAS,Der.f1含量為2.5 μg /ml);Der.f1檢測用包被抗體/檢測二抗分別來自C企業(yè)(14-1/12G2(辣根過氧化物酶標(biāo)標(biāo)記))、A企業(yè)(5-17/Der1-BD(生物素標(biāo)記))、Indoor公司(6A8/4C1(生物素標(biāo)記));粉塵螨變應(yīng)原原液(生產(chǎn)批號:20170201),由C企業(yè)提供;粉塵螨皮膚點(diǎn)刺液分別來置A企業(yè)(批號:M3781,簡稱ASPT)和B企業(yè)(編號:708,簡稱MSPT);Streptavidin-HRP(貨號:S5512),購自Sigma;牛血清白蛋白,購自索萊寶;0.01 mol/l PBS緩沖液,購自HYCLONE;TMB顯色液,購自AMRESCO;高蛋白吸附聚苯乙烯平底96孔酶標(biāo)板,購自Costa。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 ELISA法測定Der.f1含量

    各企業(yè)的Der.f1抗原標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的稀釋參照其提供的說明。Der.f1含量測定按如下經(jīng)優(yōu)化的通用方法進(jìn)行測定:96孔酶標(biāo)板中加入2 μg/ml的Der.f1測定用包被抗體,100 μl/孔,貼好封板膜后于2~8 ℃過夜;第2天洗板后,每孔加入200 μl封閉液 (1% BSA-0.01 mol/l PBS, pH 7.4),于室溫下振搖封閉約1 h;洗板;加入系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品100 μl,貼上封板膜后,于37 ℃下孵育1 h;孵育結(jié)束后取出酶標(biāo)板洗板,每孔加入100 μl檢測二抗(1∶1 000倍稀釋),37 ℃孵育1 h;采用C企業(yè)的抗體檢測體系時(shí),洗板后,每孔加入100 μl TMB顯色液,室溫下避光孵育10~20 min。每孔加入 100 μl濃度為2M的H2SO4終止液,利用ELISA酶標(biāo)儀讀取450 nm波長下的光密度值。采用Indoor公司和A企業(yè)的抗體系統(tǒng)時(shí),檢測二抗孵育及洗板后,加入100 μl鏈霉親和素-HRP偶聯(lián)二抗(1∶5 000倍稀釋),37 ℃孵育1 h,洗板后,每孔加入100 μl TMB顯色液,室溫下避光孵育10~20 min。每孔加入100 μl濃度為2M的H2SO4終止液,利用ELISA酶標(biāo)儀讀取450 nm波長下的光密度值。

    1.2.2 3種Der.f1含量測定標(biāo)準(zhǔn)品通用性比較

    按照1.2.1中方法,利用6A8/4C1抗體檢測系統(tǒng),分別以ST-H011、MS-14、EL-UAS為標(biāo)準(zhǔn)品,測定這3種標(biāo)準(zhǔn)品中的Der.f1,重復(fù)測定3次,選擇線性測定范圍內(nèi)、連續(xù)2個稀釋度下的測定結(jié)果,取平均值,計(jì)入最終結(jié)果計(jì)算。將每個標(biāo)準(zhǔn)品的測定值與其標(biāo)示值進(jìn)行比較,分析這3種標(biāo)準(zhǔn)品是否具有通用性。進(jìn)一步利用上述3種標(biāo)準(zhǔn)品測定C企業(yè)粉塵螨原液中的Der.f1的含量,比較測定結(jié)果的一致性。

    1.2.3 3種Der.f1含量測定用抗體系統(tǒng)的比較

    進(jìn)一步利用6A8/4C1、14-1/12G2、5-17/Der1-BD 3種抗體系統(tǒng),按照1.2.1中方法,以ST-H011、MS-14為標(biāo)準(zhǔn)品,互測其Der.f1含量,重復(fù)測定3次,將每個標(biāo)準(zhǔn)品的測定值與其標(biāo)示值進(jìn)行比較,分析這3種抗體系統(tǒng)的通用性。

    1.2.4 適用性分析

    以ST-H011、MS-14為標(biāo)準(zhǔn)品,利用6A8/4C1、14-1/12G2、5-17/Der1-BD 3種抗體檢測體系,分別測定A企業(yè)、B企業(yè)粉塵螨變應(yīng)原制品及C企業(yè)粉塵螨原液中的Der.f1含量,連續(xù)測定3次,對測定結(jié)果進(jìn)行比較,探索上述Der.f1含量測定用抗原標(biāo)準(zhǔn)品和抗體系統(tǒng)的適用性。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    利用GraphPad Prism 5.2對測定結(jié)果進(jìn)行one-way 和two-way ANOVA分析。

    2 結(jié)果

    2.1 3種抗原標(biāo)準(zhǔn)品中Der.f 1含量賦值比較

    利用Indoor的6A8/4C1作為檢測抗體,分別以ST-H011、MS-14、EL-UAS為標(biāo)準(zhǔn)品,測定ST-H011、MS-14、EL-UAS中Der.f1含量,其測定值與標(biāo)示值的比值結(jié)果顯示,ST-H011與MS-14用于測定Der.f1含量具有較好的通用性,兩者作為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),ST-H011、MS-14、EL-UAS的測定/標(biāo)示值無顯著差異(0.055≤t≤1.631,P>0.05),其中ST-H011、MS-14的測定結(jié)果較準(zhǔn)確,測定值/標(biāo)示值的比值均接近1,EL-UAS的測定結(jié)果誤差較大,測定值/標(biāo)示值全部大于2(圖1A)。EL-UAS與其他兩種標(biāo)準(zhǔn)品的賦值存在較大差異,用其作為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),ST-H011、MS-14與EL-UAS的測定值/標(biāo)示值比值差異均顯著(2.7≤t≤11.62,P<0.05),且ST-H011、MS-14的測定值/標(biāo)示值中最低為0.1(圖1A),表明ST-H011、MS-14與EL-UAS的賦值存在差異。進(jìn)一步用ST-H011、MS-14、EL-UAS作為標(biāo)準(zhǔn)品測定C企業(yè)的粉塵螨變應(yīng)原液,結(jié)果以ST-H011和MS-14為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),C企業(yè)粉塵螨原液中Der.f1含量分別為(56.74±7.98)μg/ml和(57.48±4.49)μg/ml,兩個測定值間沒有顯著差異(q值為0.3295,P>0.05)。以EL-UAS為標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),C企業(yè)粉塵螨原液中Der.f1含量為(14.9±1.13)μg/ml,與前兩個結(jié)果的差異顯著(q值分別為19.05、19.38,P<0.05)(圖1B)。進(jìn)一步表明ST-H011與MS-14用于測定Der.f1的含量,具有較好通用性。

    2.2 3種抗體系統(tǒng)用于Der.f 1含量測定比較

    進(jìn)一步利用3種Der.f1特異性抗體檢測系統(tǒng)(14-1/12G2、6A8/4C1和5-17/Der1-BD),分別以ST-H011和MS-14為標(biāo)準(zhǔn)品,互測其Der.f1的含量。以ST-H011做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)(圖2A),6A8/4C1、14-1/12G2、5-17/DER1-BD 3種抗體系統(tǒng)測定MS-14 中的Der.f1值分別為(93.7±5.833)μg/ml、(74.1±5.188)μg/ml、(83.9±2.853)μg/ml,與標(biāo)示值(73.2 μg/ml)的比值分別為1.28、1.01、1.15,其中14-1/12G2抗體測定MS-14中Der.f1值最接近標(biāo)示值,6A8和5-17的測定值偏離相對較大,但3個抗體測定的測定值與標(biāo)示值的比值均在0.5~2.0范圍內(nèi)(現(xiàn)階段各國均規(guī)定Der.f1含量應(yīng)為標(biāo)示量的50%~200%)。以MS-14為標(biāo)準(zhǔn)品(圖2B),6A8/4C1、14-1/12G2、5-17/DER1-BD 3種抗體測定ST-H011中Der.f1值分別為(4.6±0.196)μg/ml、(6.1±0.309)μg/ml、(5.3±0.213)μg/ml,與標(biāo)示值(6.0 μg/ml)的比值分別為0.77、1.01、0.88,其中14-1/12G2抗體測定的Der.f1值最接近標(biāo)示值,其次是5-17/DER1-BD抗體組,6A8/4C1抗體組的測定結(jié)果偏差較大,但是3種抗體系統(tǒng)測定的Der.f1的標(biāo)示值與測定值的比值亦均在0.5~2.0范圍內(nèi)。本研究結(jié)果表明3種Der.f1含量測定用抗體系統(tǒng)具有較好的通用性,其中14-1/12G2通用性最好。

    圖 13種Der.f1含量測定用標(biāo)準(zhǔn)品通用性分析

    Fig1General analysis of 3 standard products for determination ofDer.f1content

    A:3種Der.f1標(biāo)準(zhǔn)品互相標(biāo)定的結(jié)果分析; B:3種標(biāo)準(zhǔn)品測定C企業(yè)粉塵螨原液中Der.f1含量的比較

    2.3 Der.f 1含量測定用抗原、抗體系統(tǒng)的適用性分析

    利用3種Der.f1特異抗體測定系統(tǒng)(14-1/12G2、6A8/4C1和5-17/Der1-BD)及2種抗原標(biāo)準(zhǔn)品(ST-H011,MS-14)分別測定A和B兩家企業(yè)粉塵螨變應(yīng)原制品(ASPT,MSPT)中的Der.f1含量,結(jié)果見圖3A和圖3B,所測得的Der.f1含量菌符合ASPT和MSPT的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定(其中ASPT標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定Der.f1含量應(yīng)為5~20 μg/ml;MSPT標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定Der.f1含量應(yīng)為6.1~24.4 μg/ml),表明上述檢測體系具有較好的適用性,其中利用14-1/12G2作為檢測抗體測定ASPT中Der.f1含量(圖3A),兩種抗原標(biāo)準(zhǔn)品的測定結(jié)果一致性最好,差異不顯著(t=0.8798,P>0.05);利用6A8/4C1和5-17/Der1-BD作為檢測抗體測定ASPT中Der.f1,兩種標(biāo)準(zhǔn)品所測定的Der.f1值雖仍在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍內(nèi),但存在差異(t值分別為8.935,5.409;P<0.001)。同樣,利用14-1/12G2作為檢測抗體測定MSPT中Der.f1含量(圖3B),兩種抗原標(biāo)準(zhǔn)品的測定結(jié)果一致性最好,沒有顯著差異(t=2.039,P>0.05);利用6A8/4C1和5-17/Der1-BD作為檢測抗體測定MSPT中Der.f1,兩種標(biāo)準(zhǔn)品所測定的Der.f1值雖然仍在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍內(nèi),但測定結(jié)果均存在差異(t值分別為5.995,7.596;P<0.001)。進(jìn)一步利用三種抗體及2種抗原標(biāo)準(zhǔn)品測定C企業(yè)粉塵螨原液中的Der.f1含量,結(jié)果14-1/12G2抗體組中,兩種抗原標(biāo)準(zhǔn)品的測定結(jié)果一致性最好,沒有顯著差異(t=0.055,P>0.05),6A8/4C1組及5-17/Der1-BD抗體組中,兩種抗原準(zhǔn)品的測定值間差異顯著(t分別為2.689、3.807,P<0.05)(圖3C)。

    本研究的結(jié)果進(jìn)一步證明以14-1/12G2作為檢測抗體測定不同企業(yè)粉塵螨變應(yīng)原樣品中的Der.f1,適用性最好。

    3 討論

    對不同地域塵螨過敏患者的研究表明:對塵螨1組和2組主要變應(yīng)原(Der.1和Der.2)過敏的患者占塵螨過敏總?cè)丝诘谋壤浅8撸@種不同地域塵螨過敏模式高度相似的現(xiàn)狀表明Der.1和Der.2的含量穩(wěn)定對于確保塵螨變應(yīng)原制品質(zhì)量安全和有效具有重要提示意義[11]。就螨變應(yīng)原制品目前的現(xiàn)狀而言,不同廠家螨蟲培養(yǎng)及生產(chǎn)工藝均存在一些差異,從而導(dǎo)致螨變應(yīng)原提取物的蛋白組分差異較大[6, 12],甚至同一廠家生產(chǎn)的不同批次制品之間,主要變應(yīng)原含量和組分均存在較大差異[13-14],甚至采用不同的螨變應(yīng)原抗原標(biāo)準(zhǔn)品和抗體檢測體系,測定同一種螨變應(yīng)原提取物,所測得的結(jié)果也不相同,因此對主要變應(yīng)原含量測定進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化越來越被認(rèn)為是塵螨變應(yīng)原制品質(zhì)量控制的一個關(guān)鍵要素[9, 15]。

    圖 23種抗體系統(tǒng)檢測兩種標(biāo)準(zhǔn)品中Der.f1含量的結(jié)果

    Fig2Results of determination ofDer.f1content in two standard products by three anti-system

    A:以ST-H011為標(biāo)準(zhǔn)品測定MS-14中Der.f1含量; B:以MS-14為標(biāo)準(zhǔn)品測定ST-H011中Der.f1含量

    圖 3抗原標(biāo)準(zhǔn)品及抗體系統(tǒng)測定粉塵螨變應(yīng)原制品中Der.f1含量的適用性分析

    Fig3Applicability of antigen and antibody standards for determination ofDer.f1content in dermatophagoides farinae allergen products

    A:3種抗體系統(tǒng)及兩種企業(yè)抗原標(biāo)準(zhǔn)品測定ASPT中Der.f1含量; B:3種抗體系統(tǒng)及兩種企業(yè)抗原標(biāo)準(zhǔn)品測定MSPT中Der.f1含量; C:3種抗體系統(tǒng)及兩種企業(yè)抗原標(biāo)準(zhǔn)品測定C企業(yè)粉塵螨原液中Der.f1含量

    中國市售的粉塵螨變應(yīng)原制品主要來自3家企業(yè),各企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中均規(guī)定需測定制品中Der.f1含量,而測定用抗原標(biāo)準(zhǔn)品和抗體系統(tǒng)主要由各企業(yè)提供,且各企業(yè)均不相同。A企業(yè)采用自主研制的企業(yè)內(nèi)部抗原標(biāo)準(zhǔn)品(ST-H011)和抗體系統(tǒng)(5-17/Der1-BD);B企業(yè)也是采用其自主研制的企業(yè)內(nèi)部抗原標(biāo)準(zhǔn)品(MS-14),抗體系統(tǒng)則采用Indoor公司的(6A8/4C1);C企業(yè)采用INDOOR公司抗原標(biāo)準(zhǔn)品(EL-UAS)和抗體系統(tǒng)(6A8/4C1),C公司近期又新研制了一套Der.f1特異性的抗體檢測體系,即14-1/12G2,擬用于Der.f1的含量測定。因此中國亟需建立塵螨變應(yīng)原含量測定國家標(biāo)準(zhǔn)品。

    為了促進(jìn)中國塵螨變應(yīng)原制品質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化,本研究首先對中國市售粉塵螨變應(yīng)原制品中Der.f1含量測定用的3種抗原標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行的綜合比較分析,結(jié)果證明Indoor公司的抗原標(biāo)準(zhǔn)品中Der.f1賦值與A、B兩家變應(yīng)原制品生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的賦值差異較大,用其測定其他兩家企業(yè)的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)中Der.f1值,測定結(jié)果比標(biāo)示量會低3~4倍,用其測定C企業(yè)粉塵螨變應(yīng)原原液中Der.f1含量,測定值比A和B企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品所得到的測定值低3倍。Indoor公司Der.f1含量賦值低于其他的抗原標(biāo)準(zhǔn)品的其他研究也有報(bào)道[9],Indoor公司認(rèn)為其Der.f1含量低于同類標(biāo)準(zhǔn)品可能是因?yàn)槠渌麡?biāo)準(zhǔn)品中的Der.f1賦值偏高[15-16]。由于缺乏Der.f1含量測定用的國際標(biāo)準(zhǔn)品,造成上述差異原因還無法定論,但是這種Der.f1抗原標(biāo)準(zhǔn)品的賦值差異直接影響到制品中Der.f1的真實(shí)含量,進(jìn)而對臨床診斷和治療也產(chǎn)生干擾和影響。雖然EL-UAS作為天然純化的純品蛋白,用于Der.f1含量測定具有一定的優(yōu)勢,但是因其賦值與其余2家企業(yè)Der.f1含量測定標(biāo)準(zhǔn)品差異較大,若用其作為標(biāo)準(zhǔn)品,將會對多家企業(yè)的現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)生較大影響。并且多家企業(yè)均反饋El-UAS的批間穩(wěn)定性較差。而ST-H011和MS-14中的Der.f1的賦值具有較好的通用性,用其評價(jià)不同來源的粉塵螨變應(yīng)原制品,測定結(jié)果均具有可比性,因而這兩種Der.f1含量測定用企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品具有較好的適用性,未來用其對中國Der.f1測定用候選國家標(biāo)準(zhǔn)品的含量進(jìn)行賦值,對中國目前市售的粉塵螨變應(yīng)原制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不會產(chǎn)生過于明顯的影響。但是這兩種企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品也存在一定不足,即它們均不是純蛋白,而是從粉塵螨純種培養(yǎng)物中提取的天然蛋白混合物。在今后的研究中,亟需制備純化的Der.f1抗原,盡可能客觀公正的對Der.f1進(jìn)行準(zhǔn)確賦值,促進(jìn)中國粉塵螨變應(yīng)原制品中Der.f1抗原標(biāo)準(zhǔn)品的建立。

    Der.f1含量測定主要采用雙抗體夾心ELISA法,除了上述抗原標(biāo)準(zhǔn)品外,適宜的抗體檢測系統(tǒng)也是確保主要變應(yīng)原蛋白能被準(zhǔn)確測量的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究對3種Der.f1特異性抗體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行系統(tǒng)的比較分析,發(fā)現(xiàn)3種Der f1特異性抗體系統(tǒng)具有較好的通用性,與不同來源的粉塵螨變應(yīng)原提取物的特異性結(jié)合能力基本一致,對主要變應(yīng)原含量的測定結(jié)果影響較小,但是14-1/12G2抗體系統(tǒng)的測定結(jié)果最穩(wěn)定,未來可作為中國Der.f1含量檢測用抗體國家標(biāo)準(zhǔn)品研制的最佳候選。

    總之,本研究結(jié)果證明,利用2種企業(yè)Der.f1抗原標(biāo)準(zhǔn)品及3種抗體檢測系統(tǒng)測定不同來源粉塵螨變應(yīng)原提取物中Der.f1含量,均具有較好的通用性和適用性,其中用14-1/12G2抗體系統(tǒng)進(jìn)行檢測時(shí),2種抗原標(biāo)準(zhǔn)品所測定的各制品中的Der.f1含量結(jié)果偏差均最小,一致性最好。14-1/12G2未來可作為Der.f1含量測定用抗體國家標(biāo)準(zhǔn)品的候選。本研究為中國粉塵螨變應(yīng)原制品中Der.f1含量標(biāo)準(zhǔn)化奠定初步基礎(chǔ)。

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