3株豬流行性腹瀉病毒S1基因的克隆及序列分析

王婧 孫志雯 陳海峰 陳曉蘭

摘要：豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）可感染各階段的豬，使患病動物出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐，并伴隨厭食和精神沉郁等臨床癥狀，對哺乳仔豬危害尤為嚴(yán)重。為了解河南某豬場PEDV流行毒株S1基因的變異情況，以江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物藥學(xué)院實驗室保存的感染PEDV臨床病料為樣本，對其進行S1基因擴增、克隆以及序列分析。對S1基因的進化分析結(jié)果顯示，該豬場PEDV分離株S1基因推導(dǎo)的氨基酸序列之間的同源性高達(dá)99%，BLAST搜索結(jié)果顯示與AHCZ-2株的相似性最高，將獲得序列與經(jīng)典毒株CV777相比在第57位插入了4個氨基酸NQGV，在第134位插入1個氨基酸D，而在第157、158位缺失2個氨基酸，在中和表位區(qū)域共有11處氨基酸突變，與國內(nèi)其他毒株均位于G2-b進化分支，研究結(jié)果為進一步掌握該地PEDV的流行毒株和毒力變異情況提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;S1基因;遺傳進化

中圖分類號： S855.3?文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0099-04

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）以急性腸炎為特征，在仔豬常由于致死性水樣腹瀉導(dǎo)致脫水死亡的高致死率疾病[1]。病原為豬流行性腹瀉病毒（PEDV），該病毒可感染各階段的豬，使患病動物出現(xiàn)水樣腹瀉、嘔吐，并伴隨厭食和精神沉郁等臨床癥狀。仔豬的感染率可達(dá)100%，而母豬則不一定[2]。腹瀉時的排泄物可在48 h內(nèi)檢測到PEDV病毒，甚至有時可延長至4周。PEDV可感染1周齡以內(nèi)仔豬，引起嚴(yán)重水泄和3～4 d嘔吐，隨后出現(xiàn)嚴(yán)重脫水和電解質(zhì)失衡而造成死亡，平均死亡率可達(dá)到50%，在1～3日齡仔豬死亡率甚至可達(dá)到100%，然后降低至10%。雖年齡大一點的豬比1周齡以內(nèi)的仔豬初發(fā)時發(fā)病更輕，然而PEDV影響育肥豬的生長。母豬可能不會腹瀉，但是通常會顯示抑郁和厭食[3]。

PEDV是一個大的有囊膜RNA病毒，屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）成員，其基因組共約28 kb，擁有5′端非翻譯區(qū)和3′端非翻譯區(qū)，共編碼至少7個開放閱讀框（ORF1a，ORF1b，ORF2～6）其中ORF1a和ORF1b共占了整個基因組5′端2/3用于編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。剩余的3′端的基因共編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白，分別是纖突蛋白（S）、膜蛋白（M）、小膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）。其中S蛋白是病毒子包膜主要的envelope Ⅰ型糖蛋白，與病毒入侵以及刺激并誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和性抗體密切相關(guān)。S蛋白可劃分為S1（1～735 aa）和S2（736～1383 aa）2個結(jié)構(gòu)域，蛋白S1結(jié)構(gòu)域?qū)τ谧R別pAPN受體至關(guān)重要。PEDV進入細(xì)胞始于與pAPN結(jié)合，隨后通過直接膜融合的方式與靶細(xì)胞完成內(nèi)化的過程，隨后并脫殼釋放病毒基因組進入細(xì)胞內(nèi)開始復(fù)制[4-6]。

另有研究表明，冠狀病毒S蛋白的變異將會導(dǎo)致其宿主范圍、組織細(xì)胞培養(yǎng)基毒力發(fā)生改變。其中存在較高變異性的主要是S1基因，不同分離株S1基因間存在不同程度的核苷酸插入、突變和刪減等現(xiàn)象，進而改變病毒原始抗原特性，因此常被用來研究不同時間和地區(qū)流行毒株的親緣關(guān)系[7]。

本研究于2017年12月至2018年3月在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物藥學(xué)院實驗室開展，主要對該實驗室保存的豬流行性腹瀉病料進行S1基因克隆，并運用DNAMAN、MEGA等基因分析軟件進行序列分析，為進一步掌握PEDV的流行毒株和毒力變異情況提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?樣品的采集

試驗用病料為筆者所在實驗室保存的感染流行性腹瀉病毒仔豬腸道樣品。

1.2?試劑

PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）一步法RT-PCR試劑盒、EX Taq酶、Marker DL 2000、Marker DL 5000、pMD18-T載體等，均購自TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司;Trizol試劑，購自Invitrogen公司;普通質(zhì)粒提取，購自天根生化科技有限公司;瓊脂糖，購自西班牙Biowest公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3?樣品處理及RNA提取

取保存病料的小腸組織加入適量液氮進行研磨稀釋后，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min。吸取離心后上清液按照Trizol試劑提取RNA的操作步驟進行，最后將RNA溶解至DEPC水溶液中，于-20 ℃保存。

1.4?引物的設(shè)計

根據(jù)CV777毒株S基因序列作為參考，采用Primer 5.0軟件進行引物設(shè)計，引物序列為：S1-F：5′-GCTTGTTGAAGAATGGTAAGTTGC-3′;S1-R：5′-AGCCTGCTCTGAAAAAGAACAT-3′，送上海生工生物工程有限公司進行引物合成。

1.5?反轉(zhuǎn)錄及基因的PCR擴增

根據(jù)試劑盒操作說明，配制RT-PCR反應(yīng)液，將一步法酶混合物、Buffer、引物、提取的PEDV總RNA及RNase Free dH2O配制成25 μL反應(yīng)體系，按照以下程序放入PCR儀進行反應(yīng)，擴增條件為：50 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環(huán);72 ℃ 7 min，反應(yīng)結(jié)束后吸取5 μL反應(yīng)液進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.6?S1基因的克隆

電泳檢測條帶和目的條帶一致后，吸取PCR反應(yīng)混合液3 μL，pMD-18T載體1 μL，Buffer 5 μL，滅菌水1 μL，混合均勻后置于16 ℃連接2 h，并轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，進行藍(lán)白斑篩選，采用PCR法進行鑒定，鑒定成功后將陽性菌株送上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.7?序列分析

將測序得到序列采用DNA MAN軟件進行翻譯。對翻譯推導(dǎo)所得的蛋白質(zhì)序列進行BLASTp分析、并與經(jīng)典毒株CV777序列進行多序列比對，并分析其突變位點。最后與近年國內(nèi)外流行的毒株進行多序列比對，采用Mega軟件進行進化樹構(gòu)建，選擇毒株信息見表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?PEDV S1基因的擴增及克隆

將提取的PEDV RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄PCR擴增，結(jié)果顯示目的條帶約2 188 bp，將PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體進行連接，并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，采用PCR方法對重組質(zhì)粒進行鑒定，將鑒定結(jié)果為陽性的克隆菌株送測序公司進行序列測定，PCR擴增結(jié)果見圖1。

2.2?PEDV S1基因的序列分析

通過測序得到3條S1序列，分別命名為CH/HNZK1、CH/HNZK2、CH/HNZK3，長度均為2 188 bp，共編碼約720個氨基酸，3株P(guān)EDV分離株S1基因的核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列相似性為99%。對3條S1基因核酸序列進行BLAST搜索，結(jié)果均與AHCZ-2株的相似性最高，高達(dá)99%。

將推導(dǎo)氨基酸序列與經(jīng)典毒株CV777相比，在第57位插入了4個氨基酸NQGV，在第134位插入1個氨基酸D，而在第157、158位缺失2個氨基酸，與王飛等報道的我國部分地區(qū)PEDV S基因的蛋白序列[8]相似。進一步采用Clustal Omega在線軟件對所得3個S1基因推導(dǎo)蛋白質(zhì)序列和經(jīng)典毒株CV777的序列進行多序列比對發(fā)現(xiàn)，在中和表位區(qū)域（499～638 aa）共有11處突變，分別是517位A→S，521位 L→R，523位S→G，527位V→I，542位D→G，549位T→S，594位G→S，605位A→E，619位F→S，621位K→T，635位 I→V。而在預(yù)測的2處受體結(jié)合域（25～88aa、249～529 aa）分別有10處以上氨基酸突變或插入和缺失。具體突變氨基酸位點見表2。

2.3?PEDV S1蛋白遺傳進化分析

主要選擇PEDV經(jīng)典毒株CV777，中國周邊各國的疫苗株、經(jīng)典流行株，及近年來在我國境內(nèi)分離到的部分毒株與本試驗克隆所得到的3株P(guān)EDV毒株S1基因推導(dǎo)氨基酸序列進行多序列比對，并利用MEGA 5軟件，N-J法進行遺傳進化樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖2。

利用篩選得到的共50株代表毒株及本研究獲得的S1蛋白氨基酸序列構(gòu)建遺傳進化樹，可見進化樹可分為G1和G2 2個大分支，每分支可劃分為a、b 2小分支，本次試驗所得3株S1蛋白均位于G2-b分支，位于同一分支的還有中國境內(nèi)YC2014、CH/GDZH02/1、CH-SCAY-2014、HBXY-1、CH-QTC-01-2015和美國流行株USA/Colorado、CHGD-01，提示與本次分離毒株關(guān)系較近。韓國經(jīng)典毒株Chinju99、NJ02、KNU-0801和日本的KH野豬毒株均位于G2-a分支。美國流行的經(jīng)典株CV777以及LZC、DR13、Brl/87等均位于G1-a分支，CH/JLGZL/2011、JS-2004-2位于G1-b分支，而與喬涵等報道的河南分離株均位于G2[9]分支相似。

3?討論

PEDV于1982年日本首次報道后便在亞洲各國迅速流行。2000年以后，PEDV在菲律賓、泰國、越南和我國臺灣等地報道日益增加[10-11]。在90年代早期，經(jīng)典毒株CV777的滅活苗在中國廣泛被應(yīng)用，直到2010年P(guān)ED只有少數(shù)暴發(fā)[12]。但是，在2010后期PED的流行在養(yǎng)豬大省死灰復(fù)燃，我國科學(xué)家對這段時間PEDV的分子流行病學(xué)進行了大量調(diào)查。從2011年2月至2014年3月，我國進行了除西藏、海南和港、澳、臺的29省的大規(guī)模調(diào)查。樣品陽性率從61.1%到78.49%，豬場陽性率在71.43%～83.47%[13]。

2017年3月在河南周口某豬場出現(xiàn)大量哺乳仔豬腹瀉，通過對仔豬腸道樣品進行PCR以及血清ELISA檢測確定本次為PEDV感染。由于RNA聚合酶缺乏矯正功能，所以RNA病毒容易發(fā)生變異[3]。PEDV的S基因為纖突蛋白基因，是結(jié)構(gòu)蛋白中最大的基因，是主要的免疫蛋白基因，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體。而S基因可變區(qū)主要集中在S1區(qū)（1～735 aa），因此通常分析S1蛋白的序列變化情況來研究PEDV的遺傳進化關(guān)系。本研究對采集的樣品進行了S1基因的擴增和進化分析，結(jié)果顯示3份樣品的S基因與疫苗株CV777相比相似性在99%，雖然表現(xiàn)出極高的相似性，但是這3株新分離毒株相對經(jīng)典疫苗株在中和表位區(qū)域（499～638 aa）[14]共有11處氨基酸突變，有研究報道在該結(jié)構(gòu)域氨基酸突變易影響S蛋白的疏水性[15]。尤其值得注意的是被檢毒株S1蛋白中和表位區(qū)域的549位T→S、594位G→S突變現(xiàn)象，549位和594位為S蛋白的中和表位結(jié)構(gòu)域，這些位置的突變可能和免疫動物發(fā)病具有重要聯(lián)系，我國自2011年后分離的PEDV這2處均突變?yōu)榻z氨酸，而與2002—2009年期間分離到的PEDV毒株2處的突變情況差異較大[16]。

在2010年后的這些年，屬于G1-b基因群的新的變異毒株在中國被首次報道。另外，免疫動物的PED暴發(fā)使CV777毒株疫苗的保護性產(chǎn)生了質(zhì)疑。至此，PEDV在中國的不同地區(qū)流行被陸續(xù)報道。目前，中國PED暴發(fā)主要是由于G1b變異株和與CV777不同基因型的G2流行野毒[17]。對此次分析的3株P(guān)EDV病毒進行遺傳進化分析顯示均屬于G2-b分支，從親緣關(guān)系看與在河南省附近其他省份分離到的PEDV毒株親緣關(guān)系較近。這與周兵強等分析的M基因和ORF3基因結(jié)果[18]一致，與經(jīng)典毒株以及疫苗株均發(fā)生了變異，而與2010年后國內(nèi)流行的大多數(shù)毒株的同源性較高。本研究對進一步跟蹤監(jiān)測河南省PEDV分子流行特征，以及制定綜合防控措施和新疫苗的研發(fā)具有重要意義。

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