• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    白菜類作物開花時間相關(guān)基因CCA1的克隆及功能標(biāo)記開發(fā)

    2019-12-23 07:23:39劉東讓侯喜林肖棟
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年20期

    劉東讓 侯喜林 肖棟

    摘要:以1年生的油用型品種Yellow sarson(YS-143)與2年生的蕪菁品種Vegetable turnip(VT-044)的cDNA為模板,克隆出CCA1基因cDNA全長序列,分析其核苷酸多態(tài)性。在這2份材料構(gòu)建的200株F2分離群體中,選取極早和極晚開花的單株各24株,對在親本上鑒定到的4個多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,采用Pearson相關(guān)性分析研究基因型與開花時間表現(xiàn)型的關(guān)系。構(gòu)建pEZS-NL-CCA1載體,利用亞細(xì)胞定位技術(shù),分析CCA1基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。序列分析表明,YS-143與VT-044分別有1 665、1 647個核苷酸,分別編碼了554、548個氨基酸。親本之間核苷酸序列分析鑒定到12個差異位點(diǎn),氨基酸同源進(jìn)化樹分析表明,十字花科的不結(jié)球白菜、大白菜、蘿卜、油菜、擬南芥、亞麻芥聚集在同一分支中,而禾本科的大麥、玉米、水稻聚集在另一分支中。在F2分離群體上,Pearson相關(guān)性鑒定到位于親本第727至第732個堿基處的1個多態(tài)性位點(diǎn)(ACCCTT/ACCCTT),有該位點(diǎn)的群體單株平均開花時間為39 d,極顯著早于缺失該位點(diǎn)的群體單株平均開花時間104 d(P<0.01),表明白菜類作物CCA1基因的第727至第732個堿基的缺失(A05:472204-472209)與開花時間呈極顯著相關(guān),影響開花時間,可為光周期敏感的白菜類作物晚抽薹育種研究提供一定的理論依據(jù)。開發(fā)的該Insert/Delete(InDel)標(biāo)記,可以作為功能分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作,以加快育種進(jìn)程。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,CCA1基因主要在細(xì)胞核上表達(dá)。

    關(guān)鍵詞:白菜類作物;開花時間;CCA1;InDel標(biāo)記;亞細(xì)胞定位

    中圖分類號: S634.01?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2019)20-0084-07

    白菜類作物(Brassica rapa)屬于十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica),是我國乃至世界范圍內(nèi)重要的蔬菜和油料作物,主要包括大白菜、小白菜、蕪菁、菜薹、紫菜薹、白菜型油菜等多種類型[1]。油用白菜類作物包括春性和冬性歐洲生態(tài)類型、我國特有的白菜型油菜和印度的Sarson類型,以根莖膨大為主要特征的蕪菁類型是較原始的白菜類作物栽培種[2]。白菜類作物在開花習(xí)性上有1年生和2年生之分,在抽薹、開花時間上存在很大的差異。因此,白菜類作物是研究抽薹、開花變異、育種和遺傳的良好體系[3]。

    開花時間是白菜類作物生產(chǎn)中重要的農(nóng)藝性狀,是其從營養(yǎng)生長到生殖生長的重要標(biāo)志,先抽薹、開花的現(xiàn)象直接影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]。開花時間是由其內(nèi)源發(fā)育信號和多種環(huán)境因素共同調(diào)控的,其中環(huán)境溫度和光周期是主要影響因子[6]。Nelson等對起源于歐洲和澳大利亞的1年生夏季甘藍(lán)型油菜進(jìn)行了光周期敏感性觀察,同時對不同光周期(長日照、短日照)條件下的131份雙單倍體(double haploid)群進(jìn)行了開花時間(天數(shù))和開花時葉片數(shù)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)該親本及群體開花時間受光周期影響[7]。Huang等的研究表明,植物開花的光周期調(diào)控途徑涉及復(fù)雜的晝夜節(jié)律(生物鐘)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),晝夜節(jié)律(生物鐘)核心振蕩子包括CCA1和LATEELONGATEDHYPOCOTYL(LHY)等MYB類轉(zhuǎn)錄因子[8]。在擬南芥中,CCA1基因通過與TIMING OF CABEXP RESSION 1(TOC1)和LHY基因相互作用形成一個生物鐘的反饋環(huán),即CCA1和LHY基因表達(dá)達(dá)到一定量會抑制TOC1基因的表達(dá),而TOC1基因表達(dá)量升高則會促進(jìn)CCA1和LHY基因表達(dá),進(jìn)而調(diào)控植物對晝夜變化做出響應(yīng),是維持生物鐘節(jié)律的必需組分[9-11]。研究者已經(jīng)在蕓薹屬的多種類型中測序發(fā)現(xiàn),CCA1存在多個多態(tài)性位點(diǎn),表明CCA1序列變異可用于開發(fā)與育種性狀相關(guān)的分子標(biāo)記[12]。張志剛等利用CCA1基因在2個敏感性不同的大白菜品種上第329 bp(第4外顯子)處和第1 407 bp(第7外顯子)處的2段序列差異開發(fā)出2個InDel標(biāo)記,用于區(qū)分2個大白菜品種的耐抽薹性[13]。Yi等對3個蕪菁自交系(RCBr、Kenshin 和Chiifu)的DNA序列進(jìn)行分析,在CCA1基因第4內(nèi)含子上開發(fā)出1個InDel標(biāo)記[12]。白菜類作物種類繁多,僅在大白菜和蕪菁上進(jìn)行克隆序列的比較和標(biāo)記的開發(fā)具有一定局限性,而且一般認(rèn)為外顯子上的變異比內(nèi)含子上的變異更有可能影響植物的表型。在我國春季及高寒地區(qū)的秋冬白菜類作物生產(chǎn)中,先期抽薹、開花常常成為降低蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的重要難題[1]。因此,選育耐抽薹、晚開花的優(yōu)質(zhì)新品種,已經(jīng)成為白菜類作物育種中的重要目標(biāo),開發(fā)白菜類作物不同類型CCA1基因的分子標(biāo)記,可為分子標(biāo)記輔助育種提供一定的理論依據(jù)[14]。

    本研究選用早開花的油用型品種YS-143與晚開花的蕪菁品種VT-044為試材,分別觀察其在長日照和短日照2個條件下的開花時間,同時以這2個材料為模板克隆CCA1基因的cDNA序列,并利用生物信息學(xué)技術(shù)對其氨基酸序列進(jìn)行分析,開發(fā)出1個InDel標(biāo)記,最后通過驗(yàn)證,將其作為功能標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作,同時利用亞細(xì)胞定位技術(shù)鑒定了CCA1基因在細(xì)胞中的表達(dá)位置。

    1?材料與方法

    1.1?試驗(yàn)材料

    以白菜類作物中純合的1年生油用型品種YS-143(B. rapa L. ssp. oleifera)和2年生蕪菁品種VT-044(B. rapa L. em. Metzg. ssp. rapa)及它們構(gòu)建的F2分離群體為試材。親本用于不同光周期對開花時間的敏感性觀察及鑒定多態(tài)性差異位點(diǎn),F(xiàn)2代分離群體用于多態(tài)性差異位點(diǎn)的驗(yàn)證。

    RNAsimple Total RNA Kit試劑盒、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒,購自TaKaRa公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,購自Axygen公司;pEAZY-Blunt載體及大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;高保真酶MIX(Ⅰ-5TM2×High-Fidelity Master Mix)購自江蘇南京擎科生物科技有限公司;JS-3000全自動凝膠成像分析儀,購自上海培清科技有限公司。

    1.2?試驗(yàn)方法

    1.2.1?光周期敏感試驗(yàn)?2017年8月3號,將親本材料種子20粒分別在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿里催芽,25 ℃暗培養(yǎng)36 h后播種在穴盤里,分別置于長日照(光照16 h/黑暗8 h)、短日照(光照8 h/黑暗16 h),溫度22 ℃/18 ℃,相對濕度70%,光照度72 μmol/(m2·s)的光培箱中生長,1個月后定植花盆(17 cm)。同時,將F2代分離群體200株也播種在穴盤中,置于塑料大棚生長3周以后,于2017年8月24日至12月26日定植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)句容農(nóng)博園塑料大棚內(nèi),按照單株順序編號,正常田間管理。調(diào)查親本和F2代分離群體的開花時間,調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為從催芽到第1朵花開放所需要的時間(天數(shù))。

    1.2.2?CCA1基因克隆?使用RNAsimple Total RNA Kit試劑盒提取2個親本的總RNA,具體方法參照說明書。cDNA使用PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成,作為基因克隆所需的模板。CCA1基因序列參照已發(fā)表的大白菜基因組序列(http://brassicadb.org/brad/),使用在線軟件Primer 3(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增的PCR引物,并由江蘇南京擎科生物科技有限公司合成(表1)。PCR擴(kuò)增體系總體積為40 μL:正反引物各 2 μL、模板cDNA 1 μL、高保真酶MIX 20 μL、ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)程序:98 ℃預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸10 s,35個循環(huán);72 ℃延伸5 min;10 ℃保存。cDNA質(zhì)量的檢驗(yàn)采用瓊脂糖凝膠電泳方法,取5 μL DNA加入6×Loading Buffer后用1.2%瓊脂糖電泳檢測,GelRed染色,用JS-3000全自動凝膠成像分析儀進(jìn)行凝膠照相。凝膠回收方法參照AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒。目的片段膠回收后連接到pEAZY-Blunt載體上,轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,選擇陽性單克隆送至江蘇南京擎科生物科技有限公司測序。

    1.2.3?序列分析?用BioXM 2.7軟件分析2份材料CCA1基因序列的開放閱讀框(open reading frame,ORF)。不同物種CCA1基因的氨基酸序列從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中搜索獲得;同源性計(jì)算利用NCBI網(wǎng)站BLAST程序;氨基酸編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)等通過在線軟件ProtParam(https://web. expasy.org/Protparam/)完成;親/疏水性預(yù)測采用ProtScale(https://web. expasy.org/protscale/);信號肽預(yù)測采用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/);跨膜區(qū)域預(yù)測采用TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析采用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/);蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用PSIPRED(http:// bioinf.cs.ucl.ac.uk /psipred/)等在線工具;多重序列比對及進(jìn)化樹構(gòu)建通過DNAMAN 5.2進(jìn)行[15]。

    1.2.4?功能標(biāo)記開發(fā)?提取F2代群體極早和極晚開花植株各24株葉片的DNA,具體方法參照Axygen植物基因組DNA提取試劑盒說明書。對親本中鑒定到的CCA1編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)(InDels)設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物送江蘇南京擎科生物科技有限公司測序(表1)。采用t測驗(yàn)分析親本的開花時間差異顯著性。以InDel標(biāo)記基因型作為自變量,采用單因素方差分析候選標(biāo)記(InDel)與開花時間表型的相關(guān)性,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析過程中所用的軟件是SPSS 19.0。

    1.2.5?CCA1基因的亞細(xì)胞定位分析?根據(jù)YS-143中克隆出的CCA1基因序列和亞細(xì)胞定位載體pEZS-NL序列,設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的特異引物(表1)。用One Step Cloning Kit構(gòu)建載體pEZS-NL-CCA1,具體操作方法參照說明書。用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞[16],取洋蔥表皮,將其靠葉肉面向上鋪于MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 h待用,取8 μL金粉懸浮液于1.5 mL離心管中,依次加入5 μg質(zhì)粒DNA、50 μL 2.5 mol/L CaCl2、20 μL 0.1 mol/L亞精胺,冰浴20 min,其間間歇振蕩混勻。10 000 r/min離心5 s,棄上清,加入無水乙醇漂洗2次,棄上清,最后加入20 μL無水乙醇,懸浮待用。用基因槍轟擊洋蔥表皮,轟擊后暗培養(yǎng)16 h制片,用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察,并拍照記錄。

    2?結(jié)果與分析

    2.1?親本開花時間統(tǒng)計(jì)

    由圖1可知,10株親本材料YS-143在長日照條件下平均開花時間為(48±10) d,短日照條件下為(96±10) d;10株VT-044在長日照條件下平均開花時間為(105±15) d,短日照條件下在統(tǒng)計(jì)時間內(nèi)沒有開花,記為200 d。通過t測驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這2個親本在不同光周期處理下的開花時間均差異極顯著。由此證明,2個親本開花時間均受光周期影響,均為光周期敏感性材料。

    2.2?CCA1基因克隆及序列分析

    由圖2可知,YS-143的cDNA序列長度為1 665 bp,VT-044的序列長度為1 647 bp,除了前者比后者多了4段共18 bp的插入外,整個編碼區(qū)還有8處SNPs,其中2處是非同義突變。經(jīng)預(yù)測,第1段插入使YS-143的CCA1蛋白第110位后的氨基酸插入Arg和Lys 2個殘基;第2段插入使 YS-143的CCA1蛋白第242位后的氨基酸插入Thr和Leu 2個殘基;第3段使YS-143的CCA1蛋白第263位后的氨基酸插入Gly殘基;第4段使YS-143的CCA1蛋白第504位后的氨基酸插入Leu殘基;另外2處非同義突變分別是 YS-143 的CCA1蛋白第158位氨基酸由Val突變?yōu)長eu、第467位氨基酸由Gln突變?yōu)長ys。

    由圖3可知,YS-143的基因序列包含1個長為1 665 bp的ORF;該基因編碼554個氨基酸,預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)化學(xué)式為C2591H4095N781O867S14,相對分子質(zhì)量為60.5 ku,理論等電點(diǎn)為6.20,不穩(wěn)定指數(shù)為46.60,脂肪指數(shù)為57.33。ProtScale親/疏水性預(yù)測顯示,該蛋白屬于親水性蛋白,平均親水指數(shù)為-0.872。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,其主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲,分別占21.01%、76.45%,其余為延伸鏈。VT-044 的基因序列包含1個長為1 647 bp的ORF;該基因編碼548個氨基酸,預(yù)測其編碼蛋白質(zhì)化學(xué)式為 C2559H4033N771O861S14,相對分子質(zhì)量為59.8 ku,理論等電點(diǎn)為5.98,不穩(wěn)定指數(shù)為46.18,脂肪指數(shù)為56.35。ProtScale親/疏水性預(yù)測顯示,該蛋白屬于親水性蛋白,平均親水指數(shù)為 -0.877。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,其主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲,分別占23.5%、73.59%,其余為延伸鏈。2個基因所編碼蛋白質(zhì)均屬于不穩(wěn)定蛋白,無信號肽和分泌蛋白,也不存在跨膜區(qū)域,并且均在第19至第73氨基酸區(qū)域內(nèi)有3個MYB-DNA結(jié)合域。

    2.3?CCA1基因編碼的氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

    利用BLASTp分別對YS-143和VT-044的CCA1氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索與多重比對,結(jié)果(圖4、圖5)顯示它們與大白菜(登錄號為XP_009142594.1)相似性接近100%,與甘藍(lán)型油菜(登錄號為XP_013712324.1)和蘿卜(登錄號為XP_018441166.1)相似性分別為92%、73%,與擬南芥(登錄號為NP850460.1)和亞麻芥(登錄號為XP_010518363.1)相似性在65%以上,其中N端的MYB-DNA結(jié)合域的氨基酸序列相似度接近100%;與大麥(登錄號為BAJ92173.1)、玉米(登錄號為BAJ92173.1)和水稻(登錄號為AAR20887)的相似性均在35%以下,表明同科植物的氨基酸序列相似度較高。同源進(jìn)化樹分析表明,十字花科的不結(jié)球白菜、大白菜、蘿卜、甘藍(lán)型油菜、擬南芥、亞麻芥聚集在同一分支中,而禾本科的大麥、玉米、水稻聚集在另一分支中。

    2.4?功能標(biāo)記開發(fā)

    將4個InDel標(biāo)記在極早和極晚開花植株上的測序結(jié)果與植株開花時間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)第2處標(biāo)記(第727至第732個堿基的缺失)與材料開花時間關(guān)聯(lián)極顯著,其余3處不顯著。測序發(fā)現(xiàn)在F2代的24株極早開花的植株中,該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的有18株(與早花型母本YS-143一致),占總株數(shù)的75%,開花時間為31~56 d,平均開花時間39 d,基因型為ACCCTT/-的有3株,-/-的有3株;在24株極晚開花的植株中,該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的有0株,ACCCTT/-的有4株,基因型為-/-的有20株(與晚花型父本VT-044一致),占總株數(shù)的83%,開花時間為84~114 d,平均開花時間為104 d。因此,該位點(diǎn)基因型為ACCCTT/ACCCTT的植株開花時間遠(yuǎn)早于基因型為-/-的植株的開花時間,兩者之間呈極顯著差異(P<0.01)(圖6)。該InDel標(biāo)記基因型和開花時間表型的Pearson相關(guān)性分析表明,材料開花時間的早晚與基因型呈極顯著相關(guān)(r=0.991,P<0.01)。表明CCA1基因的第727至第732個堿基的變異(A05:472204-472209)與開花時間呈極顯著相關(guān),會影響植株的開花時間,可以為白菜類作物光周期影響開花時間的研究提供理論依據(jù)。同時,該位點(diǎn)可以作為功能分子標(biāo)記進(jìn)行輔助育種工作,加快育種進(jìn)程。

    2.5?CCA1基因的亞細(xì)胞定位分析

    利用亞細(xì)胞定位在線預(yù)測軟件WoLF PSORT(http://www.genscript.com/psort.html)對CCA1基因在細(xì)胞中表達(dá)的位置進(jìn)行預(yù)測,顯示CCA1基因有91.3%的可能性定位在細(xì)胞核上。而通過在洋蔥表皮中進(jìn)行的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)(圖7)發(fā)現(xiàn),在陽性對照中,細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上都能觀察到綠色熒光?而來源YS-143的CCA1蛋白的熒光信號主要集中在細(xì)胞核上,說明CCA1基因主要在細(xì)胞核上發(fā)揮功能。

    3?討論與結(jié)論

    在光周期條件下,白菜類作物具有不同的敏感性反應(yīng)。張學(xué)銘對100份白菜類作物抽薹開花性狀的光周期敏感性進(jìn)行調(diào)查,發(fā)現(xiàn)具有較大差異[3]。本研究所用材料YS-143在長日照條件下平均開花時間為(48±10) d,短日照條件下為(96±10) d;VT-044在長日照條件下平均開花時間為(105±15) d,短日照條件下在統(tǒng)計(jì)時間內(nèi)沒有開花。因此,選取的YS-143和VT-044均為光周期敏感類型,可以作為試驗(yàn)材料進(jìn)行光周期變化對開花時間影響的研究。

    研究者分別從楊樹、大麥、玉米等植物中克隆到了相應(yīng)的CCA1基因,分子進(jìn)化關(guān)系表明,它們之間氨基酸序列的同源性較高,且在單、雙子葉植物間非常保守,其N端的核酸結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似度高達(dá)79%以上[17-19]。這與本研究結(jié)果類似,筆者也發(fā)現(xiàn)2個材料與大白菜、甘藍(lán)型油菜、蘿卜的基因序列具有較高同源性,與擬南芥、亞麻芥的進(jìn)化距離也較近,其中N端的核酸結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列相似度接近100%。Yi等對來自3個蕪菁自交系(RCBr、Kenshin、Chiifu)的CCA1基因序列進(jìn)行了分析,在第4內(nèi)含子上鑒定出高水平的序列變異,并據(jù)此開發(fā)出1個InDel標(biāo)記,進(jìn)而分別用PCR及HRM(high-resolution melting)技術(shù)2種方法對其進(jìn)行驗(yàn)證,均證明該第4內(nèi)含子上的序列變異可以作為InDel分子標(biāo)記參[CM(25]與蕪菁的育種工作[12]。張志剛等在2個大白菜品種上克隆CCA1基因的cDNA序列,分別在329 bp(第4外顯子)處和第1 407 bp(第7外顯子)處開發(fā)出2個InDel分子標(biāo)記,并利用PCR法進(jìn)行了驗(yàn)證[13]。本研究選擇更有可能對植物表型造成影響的外顯子序列進(jìn)行分析,將分別在第330 bp(第4外顯子)、第726 bp(第6外顯子)、第789 bp(第6外顯子)和第1 515 bp(第7外顯子)處鑒定到的4段序列差異與F2代分離群體的開花時間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)位于第726 bp處的序列差異與開花時間相關(guān),其余3段不相關(guān)。其中第4外顯子上的序列差異與張志剛等鑒定到的序列[13]位置相近、序列相同。同時筆者也發(fā)現(xiàn),F(xiàn)2群體中基因型為ACCCTT/ACCCTT的植株的開花時間并不是都早于基因型為-/-的植株。其主要原因可能是開花時間并不只受CCA1基因控制,而是受多個開花時間相關(guān)基因和多條路徑相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)控的。在擬南芥中,發(fā)現(xiàn)CCA1基因定位在細(xì)胞核上[20]。本研究通過亞細(xì)胞定位試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),不結(jié)球白菜YS-143中的CCA1基因在細(xì)胞核上表達(dá),表明在擬南芥到白菜類作物進(jìn)化過程中,CCA1基因依然在細(xì)胞核中發(fā)揮原有的作用。

    已有研究指出,在現(xiàn)代育種中改良某個特定的優(yōu)良性狀最有效的途徑就是選擇攜帶某一性狀的目的基因的供體親本進(jìn)行回交,同時利用各種分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇,迅速地將與分子標(biāo)記連鎖的基因轉(zhuǎn)移到另外一個品種上,從而顯著加速育種年限[21]。本研究關(guān)于CCA1基因功能標(biāo)記的開發(fā)與利用,可為白菜類作物分子標(biāo)記輔助育種提供一定的理論依據(jù)和現(xiàn)實(shí)意義,為開發(fā)通用的白菜類作物InDel標(biāo)記提供了重要的一步。

    參考文獻(xiàn):

    [1]高寶禎,劉?博,李石開,等. 白菜類作物開花時間的全基因組關(guān)聯(lián)分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,50(17):3375-3385.

    [2]肖?棟. 白菜類作物開花時間和葉片性狀的遺傳分析[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

    [3]張學(xué)銘. 白菜類作物抽薹開花的遺傳分析[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2014.

    [4]李洪祥,縱瑞收,李?峰,等. 大白菜作物抽薹開花時間的分子遺傳探析[C]//中國作物學(xué)會——2015年學(xué)術(shù)年會論文集. 北京:中國作物學(xué)會,2015.

    [5]劉?靜. 大白菜高密度Bin-marker圖譜構(gòu)建及開花時間的QTL定位[D]. 北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2016.

    [6]吳昊天. 白菜類作物開花時間相關(guān)基因的表達(dá)分析[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

    [7]Nelson M N,Rajasekaran R,Smith A,et al. Quantitative trait loci for thermal time to flowering and photoperiod responsiveness discovered in summer annual-type Brassica napus L.[J]. PLoS One,2014,9(7):e102611.

    [8]Huang W,Pérez-García P,Pokhilko A,et al. Mapping the core of the Arabidopsis circadian clock defines the network structure of the oscillator[J]. Science,2012,336(6077):75-79.

    [9]Wang X X,Ma L G. Unraveling the circadian clock in Arabidopsis[J]. Plant Signaling & Behavior,2013,8(2):e23014.

    [10]Kangisser S,Yakir E,Green R M. Proteasomal regulation of CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1(CCA1) stability is part of the complex control of CCA1[J]. Plant Signaling & Behavior,2013,8(3):e23206.

    [11]Mishra P,Panigrahi K. GIGANTEA - an emerging story[J]. Frontiers in Plant Science,2015,6(8):8.

    [12]Yi H,Li X N,Lee S H,et al. Natural variation in CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 is associated with flowering time in Brassica rapa[J]. Genome,2017,60(5):402-413.

    [13]張志剛,劉栓桃,李巧云,等. 大白菜光周期調(diào)控因子CCA1的差異分析及功能標(biāo)記開發(fā)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,48(6):1-6,181.

    [14]戶秋穩(wěn),呂?煒,張蜀寧,等. 優(yōu)質(zhì)晚抽薹四倍體不結(jié)球白菜的創(chuàng)制及特性[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,38(5):757-763.

    [15]Tamura K,Peterson D,Peterson N,et al. MEGA 5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance,and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution,2011,28(10):2731-2739.

    [16]于一帆,朱小彬,葛會敏,等. 基于綠色熒光蛋白瞬時表達(dá)的植物亞細(xì)胞定位方法[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(12):58-61.

    [17]邢國芳,杜偉建,張雁明,等. 玉米晝夜節(jié)律鐘基因CCA1的克隆及表達(dá)分析[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,31(4):332-337.

    [18]邢國芳,宋?萌,姚?涵,等. 大麥(Hordeum vulgare)晝夜節(jié)律鐘基因CCA1的克隆及表達(dá)分析[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2012,32(3):207-212.

    [19]劉無雙,杜明會,陶維康,等. 楊樹生物鐘節(jié)律基因PtCCA1的克隆及表達(dá)模式研究[J]. 林業(yè)科學(xué)研究,2013,26(5):649-654.

    [20]Portolés S,Más P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis[J]. PLoS Genetics,2010,6(11):e1001201.

    [21]周道云,肖?棟,申浩冉,等. 白菜類作物開花時間相關(guān)基因BraA.FLM.a的CAPS標(biāo)記開發(fā)與利用[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,40(6):971-976.

    久久热在线av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 岛国视频午夜一区免费看| a级毛片a级免费在线| 亚洲五月婷婷丁香| 男女那种视频在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久亚洲精品不卡| 男女视频在线观看网站免费 | 国产黄片美女视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 一个人免费在线观看电影 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 一本大道久久a久久精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 一二三四社区在线视频社区8| 免费搜索国产男女视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久热爱精品视频在线9| 黄色 视频免费看| 免费av毛片视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 免费在线观看成人毛片| 国产亚洲精品av在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费电影在线观看免费观看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| av福利片在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 男人的好看免费观看在线视频 | 一二三四社区在线视频社区8| 午夜免费激情av| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲中文日韩欧美视频| av中文乱码字幕在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 午夜福利视频1000在线观看| 丁香六月欧美| 波多野结衣高清无吗| 老汉色av国产亚洲站长工具| 麻豆国产av国片精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品福利观看| 国产av一区二区精品久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 中出人妻视频一区二区| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 免费搜索国产男女视频| 欧美中文综合在线视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 久久亚洲精品不卡| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产激情久久老熟女| 不卡av一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 丝袜美腿诱惑在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日本五十路高清| 视频区欧美日本亚洲| 国产av又大| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲全国av大片| 老汉色av国产亚洲站长工具| av片东京热男人的天堂| netflix在线观看网站| 97碰自拍视频| 亚洲av电影在线进入| 热99re8久久精品国产| 国产精品野战在线观看| 我的老师免费观看完整版| 久久久久久久久久黄片| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 少妇粗大呻吟视频| 99在线人妻在线中文字幕| 好男人在线观看高清免费视频| 男女那种视频在线观看| 亚洲成人久久性| 天堂√8在线中文| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 精品电影一区二区在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| e午夜精品久久久久久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 长腿黑丝高跟| e午夜精品久久久久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 午夜影院日韩av| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 嫩草影视91久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲人与动物交配视频| 在线国产一区二区在线| 99re在线观看精品视频| 黄片大片在线免费观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 老司机靠b影院| 午夜福利免费观看在线| 久久草成人影院| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲,欧美精品.| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 最近最新免费中文字幕在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久中文字幕一级| 在线播放国产精品三级| 国产精品综合久久久久久久免费| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久伊人香网站| 婷婷精品国产亚洲av| 一进一出好大好爽视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美日韩精品网址| 国产av不卡久久| 午夜老司机福利片| 曰老女人黄片| 亚洲,欧美精品.| 久99久视频精品免费| 日韩欧美在线乱码| 国产精品久久久人人做人人爽| a在线观看视频网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 12—13女人毛片做爰片一| 亚洲无线在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 麻豆成人av在线观看| 深夜精品福利| 亚洲欧美激情综合另类| 日韩国内少妇激情av| 男人舔女人下体高潮全视频| 男插女下体视频免费在线播放| 脱女人内裤的视频| 国产在线观看jvid| 香蕉国产在线看| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 岛国视频午夜一区免费看| 国产成人aa在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲国产精品999在线| 男女之事视频高清在线观看| 国内精品久久久久精免费| 国产三级中文精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 正在播放国产对白刺激| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜福利在线观看吧| 淫妇啪啪啪对白视频| 好男人电影高清在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 人妻久久中文字幕网| 日韩中文字幕欧美一区二区| av在线天堂中文字幕| 欧美另类亚洲清纯唯美| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲人成77777在线视频| 中出人妻视频一区二区| 久久久久久九九精品二区国产 | 午夜激情av网站| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久国产成人精品二区| 欧美日韩精品网址| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 999精品在线视频| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费看日本二区| 成人国产综合亚洲| 淫秽高清视频在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 男女午夜视频在线观看| 国产精华一区二区三区| 一本大道久久a久久精品| 国产私拍福利视频在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 午夜激情av网站| 亚洲精品美女久久av网站| 两人在一起打扑克的视频| 老司机在亚洲福利影院| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日本在线视频免费播放| 波多野结衣高清无吗| 老鸭窝网址在线观看| 一本精品99久久精品77| 久久国产乱子伦精品免费另类| 中亚洲国语对白在线视频| 国产99久久九九免费精品| 午夜影院日韩av| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久香蕉国产精品| 国产片内射在线| 亚洲专区中文字幕在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线看三级毛片| 欧美精品亚洲一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品久久电影中文字幕| 久久久久久人人人人人| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 五月玫瑰六月丁香| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品不卡国产一区二区三区| 制服丝袜大香蕉在线| 中出人妻视频一区二区| 午夜福利在线在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 中文资源天堂在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久国产一级毛片高清牌| 老汉色∧v一级毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 免费在线观看黄色视频的| 岛国在线观看网站| 免费高清视频大片| 特大巨黑吊av在线直播| 999久久久国产精品视频| 国产成人精品无人区| 日韩大尺度精品在线看网址| 美女免费视频网站| 无人区码免费观看不卡| 黄色 视频免费看| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 校园春色视频在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本三级黄在线观看| 久久久久久人人人人人| 精品久久久久久久末码| 欧美一级a爱片免费观看看 | 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲最大成人中文| 精品国产美女av久久久久小说| 成人av在线播放网站| 亚洲国产精品合色在线| 久久精品综合一区二区三区| 国产高清videossex| 亚洲精品在线观看二区| 久久久久国内视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品av久久久久免费| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| √禁漫天堂资源中文www| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产免费男女视频| 久久中文字幕人妻熟女| 免费一级毛片在线播放高清视频| 黄片小视频在线播放| 少妇的丰满在线观看| 老司机靠b影院| 一级片免费观看大全| 久久久久久久久中文| 国产欧美日韩一区二区三| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品 国内视频| 亚洲国产欧美网| 久久中文看片网| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 色精品久久人妻99蜜桃| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲无线在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲美女视频黄频| 欧美一级毛片孕妇| 成人三级黄色视频| 久久久久性生活片| 999久久久精品免费观看国产| а√天堂www在线а√下载| 国产av麻豆久久久久久久| 18禁国产床啪视频网站| 午夜成年电影在线免费观看| 搡老岳熟女国产| 国内精品久久久久久久电影| 少妇粗大呻吟视频| 麻豆国产av国片精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 一个人免费在线观看电影 | 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精华一区二区三区| av免费在线观看网站| 午夜亚洲福利在线播放| 国产成+人综合+亚洲专区| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲天堂国产精品一区在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 又爽又黄无遮挡网站| 一区二区三区高清视频在线| 91国产中文字幕| 曰老女人黄片| 一个人免费在线观看电影 | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 很黄的视频免费| 国产一区二区三区视频了| 夜夜爽天天搞| 日韩精品中文字幕看吧| 18禁美女被吸乳视频| 国产激情偷乱视频一区二区| 天堂√8在线中文| 最近最新中文字幕大全电影3| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产一级毛片七仙女欲春2| 啪啪无遮挡十八禁网站| 岛国在线观看网站| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 黄色a级毛片大全视频| 国产91精品成人一区二区三区| 午夜福利成人在线免费观看| 色在线成人网| 免费看日本二区| 男女午夜视频在线观看| 很黄的视频免费| 亚洲 国产 在线| 一级作爱视频免费观看| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲自拍偷在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久久久国内视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美黑人巨大hd| 手机成人av网站| 黄频高清免费视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 看黄色毛片网站| 九色成人免费人妻av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 少妇被粗大的猛进出69影院| 中文在线观看免费www的网站 | 成人一区二区视频在线观看| 久久精品影院6| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产91精品成人一区二区三区| 色尼玛亚洲综合影院| 色噜噜av男人的天堂激情| 精品午夜福利视频在线观看一区| 搡老岳熟女国产| 少妇的丰满在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 很黄的视频免费| 神马国产精品三级电影在线观看 | 美女免费视频网站| 亚洲avbb在线观看| av欧美777| 色av中文字幕| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久99热这里只有精品18| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产一区二区在线观看日韩 | 成人午夜高清在线视频| 岛国在线观看网站| 日本 欧美在线| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 一级黄色大片毛片| 亚洲av熟女| 日本熟妇午夜| 一级片免费观看大全| 欧美日韩精品网址| 一本久久中文字幕| 悠悠久久av| 后天国语完整版免费观看| 久久香蕉精品热| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 男插女下体视频免费在线播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久性视频一级片| 午夜福利高清视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲美女黄片视频| 国产单亲对白刺激| 亚洲片人在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日韩欧美在线二视频| 亚洲片人在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 变态另类丝袜制服| 黑人操中国人逼视频| 香蕉丝袜av| 国产精品亚洲美女久久久| 国产黄色小视频在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 久久亚洲真实| 久久香蕉精品热| 一本一本综合久久| 午夜福利高清视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 18禁美女被吸乳视频| 757午夜福利合集在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 曰老女人黄片| 久久久久九九精品影院| 老汉色∧v一级毛片| 日韩有码中文字幕| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 啦啦啦免费观看视频1| 人妻久久中文字幕网| 99久久精品热视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 天堂动漫精品| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品av久久久久免费| 亚洲欧美日韩东京热| 免费搜索国产男女视频| 动漫黄色视频在线观看| 在线观看免费午夜福利视频| 久久久国产欧美日韩av| 日本三级黄在线观看| 国产av一区二区精品久久| 九色国产91popny在线| 亚洲熟妇熟女久久| 国产伦在线观看视频一区| 国产成人精品无人区| 小说图片视频综合网站| 国产真实乱freesex| 999久久久国产精品视频| 国产亚洲欧美98| 亚洲自拍偷在线| 国产精品久久电影中文字幕| 88av欧美| 9191精品国产免费久久| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美日韩精品网址| tocl精华| 久久欧美精品欧美久久欧美| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲avbb在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 黄片小视频在线播放| 怎么达到女性高潮| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲欧美日韩东京热| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 婷婷精品国产亚洲av| 中国美女看黄片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 制服诱惑二区| 一区二区三区高清视频在线| 国产视频内射| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 老汉色av国产亚洲站长工具| 午夜日韩欧美国产| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 日韩三级视频一区二区三区| 成人永久免费在线观看视频| cao死你这个sao货| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲国产精品久久男人天堂| 天堂√8在线中文| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久精品成人免费网站| 日韩欧美 国产精品| 欧美3d第一页| 香蕉av资源在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 777久久人妻少妇嫩草av网站| tocl精华| 在线视频色国产色| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99国产综合亚洲精品| av免费在线观看网站| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久伊人香网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 韩国av一区二区三区四区| 日韩av在线大香蕉| 国产高清视频在线播放一区| 特大巨黑吊av在线直播| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 日韩欧美在线乱码| 亚洲精华国产精华精| 老熟妇仑乱视频hdxx| 91麻豆av在线| 亚洲av成人av| 久久热在线av| 久久中文字幕一级| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产日本99.免费观看| 搡老岳熟女国产| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 白带黄色成豆腐渣| av福利片在线| 美女免费视频网站| 国内精品久久久久精免费| 欧美日韩乱码在线| 在线观看免费视频日本深夜| 国内精品久久久久久久电影| 在线永久观看黄色视频| 亚洲国产欧美网| 麻豆av在线久日| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产av不卡久久| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 香蕉国产在线看| 少妇人妻一区二区三区视频| 在线播放国产精品三级| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产亚洲精品一区二区www| 狠狠狠狠99中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av| 老司机午夜福利在线观看视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 中文资源天堂在线| 黄片大片在线免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲在线自拍视频| 国产三级黄色录像| 手机成人av网站| 免费在线观看黄色视频的| 午夜a级毛片| 麻豆一二三区av精品| 欧美在线一区亚洲| 悠悠久久av| 精品久久久久久成人av| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲,欧美精品.| 亚洲专区字幕在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 少妇人妻一区二区三区视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品免费久久久久久久清纯| 12—13女人毛片做爰片一| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av有码第一页| 国语自产精品视频在线第100页| tocl精华| av欧美777| 久久久久久久久中文| www.www免费av| av中文乱码字幕在线| 精品第一国产精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品综合久久久久久久免费| 91老司机精品| 国产黄色小视频在线观看| 老司机靠b影院| 亚洲精品国产一区二区精华液| 久久精品综合一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 深夜精品福利| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产真实乱freesex| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 9191精品国产免费久久| 91国产中文字幕| 99re在线观看精品视频| 中文字幕高清在线视频| 1024视频免费在线观看| 97碰自拍视频| 观看免费一级毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲第一电影网av| 成在线人永久免费视频| 999精品在线视频| 午夜成年电影在线免费观看| 国产精品精品国产色婷婷| 国产一区二区三区视频了| 欧美另类亚洲清纯唯美| 中文字幕熟女人妻在线| 国产99白浆流出| 老司机福利观看| a级毛片a级免费在线| 亚洲精品在线美女| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 九九热线精品视视频播放| 成人特级黄色片久久久久久久| 色综合欧美亚洲国产小说| 床上黄色一级片| 精品不卡国产一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 国产一区二区在线av高清观看| 婷婷精品国产亚洲av| 亚洲一区高清亚洲精品| 十八禁网站免费在线| 亚洲专区国产一区二区| www国产在线视频色| 亚洲熟妇熟女久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影|