外周血微小RNA-221與急性腦梗死病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性及對(duì)90 d預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

李紅葉，郭月萍

急性腦梗死是臨床上常見的腦血管疾病，顱內(nèi)動(dòng)脈血栓形成或血栓栓塞引起腦組織缺血缺氧損傷是造成神經(jīng)功能損害的直接原因，疾病的致殘率較高、救治難度大。盡管近些年溶栓、介入等再灌注治療手段發(fā)展迅速、急性腦梗死的治療效果明顯提高，但仍有部分患者無(wú)法獲得良好的預(yù)后、遺留不同程度的神經(jīng)功能缺損并影響日常生活[1]。目前的研究[2-4]認(rèn)為，與急性腦梗死患者神經(jīng)功能損害相關(guān)的環(huán)節(jié)包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及自噬等。尋找參與上述環(huán)節(jié)的關(guān)鍵分子不僅有助于闡明急性腦梗死后神經(jīng)損傷的分子機(jī)制，也有助于發(fā)現(xiàn)評(píng)估急性腦梗死病情及預(yù)后的分子指標(biāo)。

微小RNA(miR)是近年來(lái)表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控多種基因表達(dá)并參與炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等環(huán)節(jié)的調(diào)控。孫瑛等[5]的研究表明，大鼠缺血再灌的腦組織中miR-221表達(dá)減少，尾靜脈注射miR-221激動(dòng)劑能夠減輕腦缺血再灌注損傷并抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，表明miR-221可能在急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起保護(hù)作用。基于此，本研究將外周血miR-221表達(dá)用于急性腦梗死患者的病情評(píng)估，具體分析了外周血miR-221與急性腦梗死病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性及對(duì)90 d預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選擇2017年5月至2019年5月我院收治的108例急性腦梗死患者作為腦梗死組，入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合急性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)發(fā)病時(shí)間≤72 h；(3)臨床資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并腦出血；(2)既往有腦梗死、腦出血、腦外傷病史；(3)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病。另取同期體檢的120名健康者作為對(duì)照組。腦梗死組中男性67例，女性41例；年齡41～64歲，平均(52.18±10.24)歲；對(duì)照組中男性70人，女性50人；年齡40～60歲，平均(50.19±11.75)歲。兩組間一般資料的比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 外周血miR-221表達(dá)的檢測(cè) 采用北京博凌科為公司的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。腦梗死組患者入院后采集外周靜脈血3 ml，對(duì)照組受試者體檢時(shí)采用外周靜脈血3 ml。采用全血miR提取試劑盒分離外周血中的miR。采用miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將外周血中的miR反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用miRNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒配置反應(yīng)體系如下：cDNA樣本1 μl、qPCR Mix 10 μl、10 μmol/L上下游引物各0.4 μl、去離子水補(bǔ)足至20 μl；在熒光定量PCR儀上按照二步法進(jìn)行反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性2～3 min，94 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s重復(fù)40個(gè)循環(huán)，生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，根據(jù)Ct值、以U6為內(nèi)參，計(jì)算miR-221的表達(dá)水平。

1.2.2 腦梗死病情嚴(yán)重程度的評(píng)價(jià) 根據(jù)入院時(shí)NIHSS評(píng)分評(píng)價(jià)神經(jīng)缺損程度，NIHSS評(píng)分0～15分為輕中度、≥16分為重度；根據(jù)入院后影像學(xué)檢查所見梗死灶直徑評(píng)價(jià)腦梗死面積，直徑>4 cm為大面積梗死、≤4 cm為中小面積梗死。

1.2.3 90 d預(yù)后的評(píng)價(jià) 腦梗死組患者出院后90 d時(shí)進(jìn)行門診復(fù)診，根據(jù)mRS評(píng)分評(píng)價(jià)患者的預(yù)后，mRS≤2分為預(yù)后良好、mRS>2分為預(yù)后不良。

1.2.4 預(yù)后相關(guān)因素的收集 根據(jù)腦梗死組患者的病歷資料，收集以下信息：性別、年齡、高血壓病、冠心病、糖尿病、心房顫動(dòng)(房顫)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、隨機(jī)血糖、同型半胱氨酸(Hcy)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、發(fā)病到入院時(shí)間、腦梗死直徑。TC、LDLC、HDLC、隨機(jī)血糖、Hcy、hs-CRP采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定，腦梗死直徑根據(jù)影像學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行測(cè)量，其他資料根據(jù)病史進(jìn)行判斷。

2 結(jié) 果

2.1 腦梗死組與對(duì)照組外周血miR-221表達(dá)水平的比較 見表1。腦梗死組患者外周血miR-221的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

表1 腦梗死組與對(duì)照組外周血miR-221表達(dá)水平的比較

2.2 腦梗死組中不同病情嚴(yán)重程度患者外周血miR-221表達(dá)水平的比較 見表2、圖1。與腦梗死組中輕中度神經(jīng)功能缺損患者比較，重度神經(jīng)功能缺損患者外周血miR-221的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與腦梗死組中中小面積梗死患者比較，大面積梗死患者外周血miR-221的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。經(jīng)Pearson檢驗(yàn)，腦梗死組患者外周血miR-221的表達(dá)水平與NIHSS評(píng)分及梗死面積具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.700和-0.718(均P<0.001)。

圖1 腦梗死組患者外周血miR-221的表達(dá)水平與NIHSS評(píng)分及梗死面積的相關(guān)性

表2 腦梗死組中不同病情嚴(yán)重程度患者外周血miR-221表達(dá)水平的比較

2.3 腦梗死組中預(yù)后良好患者與預(yù)后不良患者外周血miR-221表達(dá)水平及臨床特征的比較 見表3。根據(jù)90 d mRS評(píng)分，腦梗死組108例患者中共46例預(yù)后不良，發(fā)生率為42.59%。腦梗死組中預(yù)后良好患者與預(yù)后不良患者比較，性別、年齡、高血壓病、冠心病、糖尿病、房顫、腦梗死直徑、TC、LDLC、HDLC、隨機(jī)血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與腦梗死組中預(yù)后良好患者比較，預(yù)后不良患者外周血miR-221的表達(dá)水平明顯降低，入院時(shí)NIHSS評(píng)分、Hcy水平、hs-CRP水平明顯升高，發(fā)病到入院時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表3 腦梗死組中預(yù)后良好患者與預(yù)后不良患者miR-221及臨床特征的比較[例(%)，±s]

表3 腦梗死組中預(yù)后良好患者與預(yù)后不良患者miR-221及臨床特征的比較[例(%)，±s]

因素預(yù)后良好患者(n=62)預(yù)后不良患者(n=46)χ2/t值P值男性36(58.06)31(67.39)0.9750.323年齡(歲)51.39±10.0953.25±11.030.9100.365高血壓病30(48.39)26(56.52)0.7000.403冠心病2(3.23)3(6.52)0.6500.420糖尿病15(24.19)14(30.43)0.6320.427房顫4(6.45)5(10.87)0.6750.411發(fā)病到入院時(shí)間(h)24.24±6.5132.19±7.855.746<0.001入院時(shí)NIHSS評(píng)分(分)4.77±0.938.18±1.8312.648<0.001腦梗死直徑(cm)3.73±0.894.21±0.942.7060.008TC(mmol/L)4.39±0.924.67±1.041.4790.142LDLC(mmol/L)3.09±0.623.24±0.821.0830.281HDLC(mmol/L)1.15±0.311.04±0.371.6780.096隨機(jī)血糖(mmol/L)7.14±1.218.03±1.553.3510.001Hcy(μmol/L)11.48±2.9516.05±3.417.447<0.001hs-CRP(mg/L)6.11±1.748.29±1.816.329<0.001miR-2210.75±0.250.51±0.175.616<0.001

2.4 腦梗死組患者預(yù)后不良影響因素的Logistics回歸分析 見表4。以腦梗死組患者預(yù)后為應(yīng)變量，以單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的miR-221、入院時(shí)NIHSS評(píng)分、腦梗死直徑、隨機(jī)血糖、Hcy、hs-CRP、發(fā)病到入院時(shí)間作為自變量進(jìn)行Logistics回歸分析顯示，miR-221、入院時(shí)NIHSS評(píng)分、腦梗死直徑、Hcy是腦梗死組患者預(yù)后不良的影響因素(均P<0.05)。

表4 腦梗死組患者預(yù)后不良影響因素的logistics回歸分析

2.5 外周血miR-221預(yù)測(cè)腦梗死組患者預(yù)后不良的ROC曲線分析 見圖2。繪制外周血miR-221預(yù)測(cè)腦梗死組患者預(yù)后不良的ROC曲線，曲線下面積為0.7923(P<0.0001)。根據(jù)約登指數(shù)最大值確定miR-221預(yù)測(cè)腦梗死組患者預(yù)后不良的最佳截點(diǎn)為0.60，該最佳截點(diǎn)預(yù)測(cè)預(yù)后不良的靈敏度和特異性分別為67.74%和71.74%。

圖2 外周血miR-221預(yù)測(cè)腦梗死組患者預(yù)后不良的ROC曲線

3 討 論

miR-221是具有心腦血管保護(hù)作用的miR，國(guó)內(nèi)孫瑛等[5]的實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)miR-221在大鼠缺血再灌的腦組織中表達(dá)減少，使用miR-221激動(dòng)劑能夠減輕腦缺血再灌注損傷；Peng等[7]的研究證實(shí)缺血性腦卒中患者外周血miR-221的表達(dá)減少，并且在離體培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中、miR-221能夠增強(qiáng)內(nèi)皮功能；Zhou等[8]的研究證實(shí)miR-221能夠減輕心肌梗死大鼠的心肌損傷及重構(gòu)。本研究對(duì)急性腦梗死患者外周血miR-221表達(dá)的分析結(jié)果與Peng等[7]的研究一致，即腦梗死組外周血miR-221的表達(dá)水平明顯降低。結(jié)合miR-221在腦梗死及心肌梗死中的保護(hù)作用，本研究進(jìn)一步分析了miR-221表達(dá)與腦梗死病情的關(guān)系，通過(guò)神經(jīng)功能缺損程度及腦梗死面積判斷病情嚴(yán)重程度并分析miR-221的差異可知，重度神經(jīng)功能缺損、大面積梗死患者外周血miR-221的表達(dá)水平明顯降低，表明miR-221表達(dá)越低、急性腦梗死患者的神經(jīng)缺損越重且腦梗死面積越大，與miR-221在動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中介導(dǎo)的心腦血管保護(hù)作用吻合。心肌梗死相關(guān)的臨床研究[9]表明，miR-221對(duì)心肌梗死患者的預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值，而miR-221與腦梗死預(yù)后的關(guān)系尚不明確。根據(jù)目前的基礎(chǔ)研究，miR-221的生物學(xué)作用包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等。急性腦梗死的相關(guān)研究[10-12]表明，炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡是與神經(jīng)功能損害密切相關(guān)的因素，神經(jīng)功能損害的加劇會(huì)影響遠(yuǎn)期預(yù)后、使致殘率增加。國(guó)內(nèi)多項(xiàng)關(guān)于急性腦梗死患者預(yù)后的研究均以出院后90 d作為評(píng)估預(yù)后的時(shí)間點(diǎn)，有研究[13-15]結(jié)果顯示，急性腦梗死患者90 d預(yù)后不良的發(fā)生率分別為36.48%、51.43%、41.41%。本研究也對(duì)急性腦梗死患者的90 d預(yù)后進(jìn)行了評(píng)價(jià)，108例患者中共46例為預(yù)后不良，發(fā)生率為42.59%，與上述研究結(jié)果相似。進(jìn)一步比較預(yù)后良好與預(yù)后不良患者入院時(shí)miR-221表達(dá)的差異可知，預(yù)后不良患者外周血中miR-221的表達(dá)水平明顯低于預(yù)后良好患者，表明miR-221表達(dá)降低不僅與急性腦梗死的發(fā)生及病情的加重有關(guān)，還可能是造成90 d預(yù)后不良的因素之一。急性腦梗死患者的預(yù)后受到多因素、多環(huán)節(jié)的影響，miR-221表達(dá)減少可能通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡來(lái)影響預(yù)后，同時(shí)其他因素也可能影響預(yù)后。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)關(guān)于急性腦梗死預(yù)后影響因素的研究[13-17]發(fā)現(xiàn)，入院時(shí)NIHSS評(píng)分增加、大面積腦梗死、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(NLR)增加、高Hcy血癥是急性腦梗死預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究采用單因素分析及Logistic回歸分析的方法對(duì)急性腦梗死預(yù)后不良的影響因素進(jìn)行了探究，同時(shí)對(duì)急性腦梗死患者的臨床特征及miR-221的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，miR-221、入院時(shí)NIHSS評(píng)分、腦梗死直徑、Hcy是腦梗死組患者預(yù)后不良的影響因素，入院時(shí)NIHSS評(píng)分、腦梗死直徑、Hcy與預(yù)后不良相關(guān)的結(jié)果與既往國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究吻合，miR-221與預(yù)后不良相關(guān)的結(jié)果與miR-221介導(dǎo)的心腦血管保護(hù)作用吻合。最后，本研究還通過(guò)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)入院時(shí)miR-221表達(dá)對(duì)預(yù)后不良具有預(yù)測(cè)價(jià)值，預(yù)測(cè)的最佳截點(diǎn)為0.60。

綜上所述，外周血miR-221表達(dá)減少與急性腦梗死病情加重、90 d預(yù)后不良有關(guān)，miR-221表達(dá)對(duì)90 d預(yù)后具有預(yù)測(cè)價(jià)值，未來(lái)miR-221有望成為評(píng)價(jià)急性腦梗死病情及預(yù)后的標(biāo)志分子，也有望作為急性腦梗死新的治療靶點(diǎn)。