豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液熱原檢查研究

徐 磊 朱曉瑋 周永銀 許秀梅 杜 君 劉小龍 賴隆永 林祚貴 黃 瑜

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院 福州 350119；2.南京天邦生物科技有限公司 南京 211102；3.派生特（福州）生物科技有限公司 福州 350500；4.福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所 福州 350013）

轉(zhuǎn)移因子（Transfer Factor，TF）是白細胞中具有免疫活性的T淋巴細胞所釋放的一類可透析小分子物質(zhì)，屬于多肽類物質(zhì)，其肽分子比蛋白質(zhì)小很多，具有效果顯著、作用迅速、無抗原性、使用安全、無毒副作用、無藥物殘留等優(yōu)點[1-3]，被廣泛運用于人類和獸醫(yī)臨床領(lǐng)域，具有十分重要的理論研究和應(yīng)用價值[4-11]。熱原是微生物的代謝產(chǎn)物，是可引起人、豬、雞等恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)[12]。熱原檢查法作為檢查熱原的一種基準方法，系將一定劑量的待檢樣品經(jīng)靜脈注入兔體后，觀察家兔體溫的升高情況，以判定待檢樣品所含熱原限度是否符合規(guī)定，半個多世紀以來一直被廣泛用于藥品和生物制品的熱原檢查，為醫(yī)藥安全作出了巨大貢獻[13-14]。

為了建立TF的熱原檢查方法及對其制造工藝進行驗證，本試驗按照課題組已授權(quán)國家發(fā)明專利制備3批TF[15-17]，通過熱原檢查法對3批TF進行熱原檢查研究，以期明確發(fā)明專利制造工藝對熱原的去除效果，為獸用TF的規(guī)?；苽涮峁┫嚓P(guān)試驗參考。

1 材料和方法

1.1 試驗動物 家兔購自福建省連江劉氏兔業(yè)養(yǎng)殖場，經(jīng)檢驗符合現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄“熱原檢查法”供試用家兔要求，即試驗用家兔體重1.7 kg以上，健康合格，雌兔無孕。試驗前7 d，體重無減輕，食欲、排泄、精神等無異?，F(xiàn)象。

1.2 TF制備 參照本課題組已授權(quán)的國家發(fā)明專利制備3批TF[15-17]：以健康豬脾臟為原料，經(jīng)勻漿、細胞破碎、滅活、微濾、超濾后精制而成，3批TF分別為TF-1、TF-2、TF-3。 經(jīng)檢驗，所制備 3批TF的pH值分別為6.88、6.92和6.96，多肽含量分別為2.92 mg/mL、2.68 mg/mL 和 2.60 mg/mL，核糖含量分別為 59.8 μg/mL、58.4 μg/mL 和 56.3 μg/mL，脫 E 受體法效力分別為15.7%、15.4%和17.1%，細菌內(nèi)毒素含量均不超過10 EU/mL，在250～260 nm處有最大吸收峰（均為253 nm），OD260nm/OD280nm的比值均大于 1.9（分別為 2.29、2.30和 2.32），外源病毒檢驗、支原體檢驗、無菌檢驗、蛋白質(zhì)定性檢驗、過敏反應(yīng)檢查、異常毒性檢查、安全檢驗均合格。

1.3 試驗設(shè)計 取家兔9只，隨機分成3組：第1組、第2組和第3組，每組3只家兔，分別編號1～9。選取TF-1、TF-2和TF-3作為待檢樣品，分別以0.5 mL/kg劑量經(jīng)耳靜脈緩緩注入第1組、第2組和第3組家兔，開展熱原檢查試驗，試驗設(shè)計見表1。

表1 熱原檢查試驗設(shè)計

1.4 熱原檢查試驗

1.4.1 試驗前準備 與待檢樣品接觸的試驗用器皿為無菌、無熱原器皿。在開始熱原檢查試驗前1 d，家兔處于同一溫度的環(huán)境中，飼養(yǎng)室和實驗室的溫度相差不大于3℃，且控制在17～25℃，在試驗過程中，實驗室溫度變化不大于3℃，并防止動物騷動及避免噪聲干擾。家兔在試驗前2 h停止給食，并置于寬松適宜的裝置中至試驗完畢。肛溫計（精密度為±0.1℃）插入肛門的深度及時間各兔均一致，其中，深度約6 cm，時間2 min，每隔30 min測量體溫1次，共測量2次，兩次體溫之差不高于0.2℃，兩次體溫平均值作為該兔的正常體溫。且正常體溫在38～39.6℃范圍，同組各兔間的正常體溫之差不高于1℃。

1.4.2 檢查法 在測定家兔正常體溫后15 min內(nèi)，經(jīng)耳靜脈緩緩注入0.5 mL/kg劑量并溫熱至約38℃的待檢樣品，然后每隔30 min測量1次，共測量6次，以6次體溫中最高的一次減去正常體溫，即為該兔體溫的升高溫度 （當家兔升溫為負值時以0℃計）。如果3只家兔中有1只體溫升高不低于0.6℃，或3只家兔體溫升高的總和不低于1.3℃，應(yīng)另取5只家兔進行重檢，檢查方法同上。

1.4.3 結(jié)果判斷 在首免的3只家兔中，體溫升高均低于0.6℃，并且3只家兔的體溫升高總和低于1.3℃；或在重檢的5只家兔中，體溫升高不低于0.6℃的家兔不超過1只，并且首免、重檢合并8只家兔的體溫升高總和不高于3.5℃，均判定待檢樣品的熱原檢查結(jié)果符合規(guī)定。

在首免的3只家兔中，體溫升高不低于0.6℃的家兔超過1只；或在重檢的5只家兔中，體溫升高不低于0.6℃的家兔超過1只；或在首免、重檢合并8只家兔的體溫升高總和高于3.5℃，均判定待檢樣品的熱原檢查結(jié)果不符合規(guī)定。

2 結(jié) 果

按試驗方法進行操作，測得各家兔正常體溫和升高體溫，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，待檢樣品注射后各家兔的體溫升高值均小于0.6℃，且各組的3只家兔體溫升高值總和均小于1.3℃。因此，判定3批TF的熱原檢查結(jié)果均符合現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定。

表2 熱原檢查結(jié)果

3 討 論

在醫(yī)學發(fā)展史上，注射給藥方式的創(chuàng)立是一個重大的進步，其在人類與疾病斗爭過程中發(fā)揮著重要作用。但是至今，臨床上常因輸注藥液而引起機體出汗、高熱、嘔吐、昏迷甚至危及生命，被稱為熱原反應(yīng)[18]。

熱原是能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質(zhì)，其在機體作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，使機體散熱減少、產(chǎn)熱增加，表現(xiàn)出體溫上升等熱原反應(yīng)。細菌內(nèi)毒素脂多糖被認為是最主要的熱原，所有已知的細菌內(nèi)毒素脂多糖均具有很強的熱原活性。當前，常用的熱原檢測方法主要有細菌內(nèi)毒素檢測法（鱟試劑）和家兔法。其中，家兔熱原檢測法的優(yōu)點是能夠反映熱原所引起哺乳動物復(fù)雜的升溫過程，該方法不僅可檢測出細菌內(nèi)毒素的致熱原，而且能檢查出非細菌內(nèi)毒素的致熱原，適用于較多種類的熱原物質(zhì)檢查[19-20]。

自20世紀50年代發(fā)現(xiàn)TF至今，TF作為具有非特異性活性和特異性免疫活性的細胞調(diào)節(jié)因子，國內(nèi)外學者對其開展了大量研究[21-27]。本試驗按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄“熱原檢查法”，對本課題組已授權(quán)國家發(fā)明專利所制備的3批TF開展熱原檢查研究，結(jié)果顯示，3批TF的熱原檢查結(jié)果均符合現(xiàn)行《中國獸藥典》規(guī)定，表明本發(fā)明專利制造工藝可有效去除熱原，保證TF制品的安全性。