急性白血病患兒血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)變化及其意義

許惠敏，馬志英，郭楠

開封市兒童醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護(hù)室，河南 開封 475000

鐵元素是細(xì)胞增殖所必須的元素，與細(xì)胞周期調(diào)控、遺傳物質(zhì)合成和表達(dá)、能量代謝等均有密切關(guān)系[1]。鐵蛋白（ferritin，SF）是水溶性氧化鐵磷酸化合物，其主要功能為儲(chǔ)存鐵。研究表明，鐵代謝異常與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)[2]。腫瘤組織分化早期，幼稚細(xì)胞增殖與分化需要大量鐵元素參與，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TFR）大量表達(dá)，因而推測(cè)轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）、TFR可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著一定聯(lián)系，可用于評(píng)估腫瘤的侵襲程度。本研究對(duì)急性白血病患兒血清TFR的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并對(duì)其與白血病患兒臨床特征、療效和預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月至2018年1月開封市兒童醫(yī)院收治的82例急性白血病患兒為觀察組，所有患兒均經(jīng)外周血細(xì)胞分析、骨髓形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)等檢查確診為急性白血??；符合急性髓系白血?。◤?fù)發(fā)難治性）中國診療指南（2011年版）[3]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且均未合并其他系統(tǒng)腫瘤、肝腎功能嚴(yán)重不全、認(rèn)知障礙或精神疾病。觀察組中，男52例，女30例；年齡2～16歲，平均（10.95±4.27）歲；疾病類型：急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）31例，急性髓細(xì)胞性白血病（acute myeloid leukemia，AML）51例；初診53例，復(fù)發(fā)29例；白細(xì)胞（white blood cell，WBC）計(jì)數(shù)為（16～128）×109/L，平均WBC計(jì)數(shù)為（32.15±26.34）×109/L；白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)為（0.62～1.35）×109/L，平均白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)為（1.05±0.31）×109/L；白血病危險(xiǎn)分級(jí)：低危20例，中危29例，高危33例。另外，選取同期于開封市兒童醫(yī)院行健康體檢的健康兒童50例為對(duì)照組，均排除缺鐵性貧血、先天性TF缺乏等疾?。粚?duì)照組中，男29例，女21例；年齡1～15歲，平均（11.03±5.02）歲。兩組受試者的年齡、性別比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有受試者及家屬均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

采集觀察組患兒入院2天內(nèi)及對(duì)照組受試者體檢時(shí)的清晨空腹靜脈血5 ml，分別注入2個(gè)試管中，一份用于檢測(cè)血清中SF、TF、TFR蛋白水平，一份用于檢測(cè)TFRmRNA水平。采用酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunoreaction，ELISA）法檢測(cè)血清SF、TF、TFR蛋白水平，試劑盒購自Beckman公司。TFRmRNA檢測(cè)標(biāo)本經(jīng)過硼酸鈉溶液重懸，加入淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)離心后取中間白霧狀即單個(gè)核細(xì)胞層，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌、離心，去上清，加入3 ml PBS緩沖液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。收集細(xì)胞加入0.5 ml TRIzol試劑（購自美國Invitrogen公司），經(jīng)勻漿、離心處理后取無色水相層，沉淀RNA，再次離心取沉淀物，洗滌，離心棄上清，室溫下晾至沉淀物干燥，Nanodrop ND-2000紫外分光光度法鑒定RNA純度和完整性。Reverse Transcription Ki（t購自美國GIBICOL公司）將符合A260nm/A280nm≥1.8的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）系統(tǒng)定量7500 PCR儀（購自美國ABI公司）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase，RT-PCR）反應(yīng)，Primer Premier 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin作為內(nèi)參，紫外燈下觀察結(jié)果。2-ΔΔCt法計(jì)算TFRmRNA的相對(duì)表達(dá)量。RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，72 ℃ 35 s，共32個(gè)循環(huán)。

1.3 治療方法及療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

AML患兒采用高三尖杉酯堿+阿糖胞苷治療，ALL患兒采用柔紅霉素+長春新堿+強(qiáng)的松+門冬酰胺酶治療。療效評(píng)價(jià)：治療結(jié)束2周，骨髓穿刺復(fù)查骨髓細(xì)胞形態(tài)，參照血液病學(xué)診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[4]分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、未緩解（NR）。所有患兒均隨訪至2019年1月，統(tǒng)計(jì)患兒死亡、腫瘤復(fù)發(fā)的比例，及無疾病進(jìn)展生存率（progressive-free survival rate，PFS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析TFRmRNA是否為急性白血病患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清SF、TF、TFR蛋白和TFRmRNA水平的比較

觀察組受試者血清中SF、TF、TFR蛋白水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；觀察組受試者的TFRmRNA水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組別受試者血清SF、TF、TFR蛋白和TFR mRNA水平的比較（±s）

表1 不同組別受試者血清SF、TF、TFR蛋白和TFR mRNA水平的比較（±s）

組別觀察組（n=82）對(duì)照組（n=50）t值P值SF（ng/ml）361.24±32.15 102.01±16.32 52.952 0.000 TF（g/L）3.67±0.25 2.13±0.19 37.441 0.000 TFR（mg/L）3.26±0.62 1.13±0.43 21.348 0.000 TFR mRNA 3.26±0.43 1.03±0.25 33.363 0.000

2.2 TFRmRNA 水平與急性白血病患兒臨床特征的關(guān)系

不同WBC計(jì)數(shù)、白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)、白血病危險(xiǎn)分級(jí)急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；不同性別、年齡、白血病類型急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.3 不同治療時(shí)間和療效急性白血病患兒TFR mRNA 水平的比較

治療后，急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量為（1.85±0.35），明顯低于治療前的（3.29±0.43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=23.159，P＜0.01）。治療后，82例急性白血病患兒中，CR 35例，PR 29例，NR 18例，分別作為CR組、PR組和NR組；CR組、PR組、NR組患兒的TFRmRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為（2.43±0.26）、（3.33±0.45）、（4.71±0.52），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=195.181，P＜0.01）；CR組急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量低于PR組和NR組，PR組急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量低于NR組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.998、21.379、9.628，P＜0.05）。

表2 不同臨床特征急性白血病患兒TFR mRNA水平的比較

2.4 TFRmRNA水平與急性白血病患兒預(yù)后的關(guān)系

截至隨訪結(jié)束，82例急性白血病患兒的隨訪時(shí)間為6～36個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為25個(gè)月，隨訪期間6例患兒死亡，16例患兒復(fù)發(fā)；PFS為73.2%（60/82）；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，TFRmRNA為急性白血病患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素（RR=1.276，95%CI：1.105～1.467，χ2=13.562，P＜0.05）。

3 討論

鐵是人體發(fā)育所必需的微量元素，鐵通過腸道吸收與TF結(jié)合輸送至全身，并與TFR結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的生長、增殖等過程。鐵代謝異常可影響正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)貧血和免疫力下降[5]，因此，鐵代謝異常被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。SF作為反映機(jī)體貯存鐵的指標(biāo)，與肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。相關(guān)研究表明，乳腺癌患者血清中SF呈高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)水平與乳腺癌患者的病理分級(jí)密切相關(guān)，表明血清SF在乳腺癌診斷中可能具有較高的臨床價(jià)值[8-9]。白血病屬于造血系統(tǒng)惡性腫瘤，患者多出現(xiàn)貧血、感染等癥狀，白血病細(xì)胞可浸潤機(jī)體的各個(gè)組織器官，導(dǎo)致多臟器、系統(tǒng)功能衰竭，臨床病死率較高[10-11]。血清TFR與急性白血病是否存在某種聯(lián)系尚需更多臨床研究證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示，觀察組患兒的血清SF、TF、TFR蛋白水平及TFRmRNA水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其原因可能為白血病患兒機(jī)體鐵處于高度代謝狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞大量增殖、分化均需要大量鐵元素參與，因此急性白血病患兒TFR表達(dá)水平明顯升高，以促進(jìn)鐵元素向腫瘤細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，不同WBC計(jì)數(shù)、白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)、白血病危險(xiǎn)分級(jí)急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；提示TFRmRNA水平與急性白血病患兒的病情嚴(yán)重程度、危險(xiǎn)程度密切相關(guān)，TFRmRNA水平可以反映白血病患兒的病情。相關(guān)研究指出，白細(xì)胞可以分泌白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6等炎性因子，炎性因子與細(xì)胞膜受體結(jié)合可以促進(jìn)TFR轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，白血病患兒機(jī)體炎癥程度越高，血清TFR水平越高，患兒貧血程度越嚴(yán)重，患兒的病情危險(xiǎn)程度越大[12-14]；還有研究顯示，白血病患兒白血病細(xì)胞數(shù)量增多時(shí)，TF的合成和分泌也增多，導(dǎo)致血清TF水平明顯升高[15-16]。本研究結(jié)果顯示，白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)高（≥0.8×109/L）的急性白血病患兒TFRmRNA表達(dá)水平高于白血病細(xì)胞計(jì)數(shù)低（＜0.8×109/L）的患兒（P＜0.05），提示TFRmRNA可能可以用于評(píng)估急性白血病患兒的病情。

本研究對(duì)TFRmRNA表達(dá)水平與急性白血病患兒臨床療效的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療后，急性白血病患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于治療前（P＜0.01），且CR組患兒的TFRmRNA相對(duì)表達(dá)量低于PR組和NR組（P＜0.05），表明化療后，急性白血病患兒的鐵代謝程度降低，貧血癥狀改善，提示TFRmRNA可以較好地反映白血病患兒的臨床治療效果，與相關(guān)研究結(jié)果一致[17-18]。已有研究顯示，SF相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)在成人白血病的療效評(píng)估中具有較好的價(jià)值[19]，但關(guān)于TFRmRNA與急性白血病患兒預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究對(duì)82例急性白血病患兒進(jìn)行隨訪，并經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析，結(jié)果顯示TFRmRNA為急性白血病患兒預(yù)后的危險(xiǎn)因素，提示TFRmRNA表達(dá)水平越低，患兒的PFS越高，TFRmRNA是影響白血病患兒預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素。翟勇等[20]對(duì)50例乳腺癌患者的血清TFR水平與5年生存率的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生存患者的血清TFR水平低于死亡患者，血清TFR水平與患者的5年生存率呈負(fù)相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。上述研究結(jié)果提示，TFRmRNA表達(dá)水平與急性白血病患兒的預(yù)后有關(guān)，可能作為評(píng)價(jià)白血病患兒預(yù)后的重要指標(biāo)。

綜上所述，急性白血病患兒TFRmRNA水平明顯增高，其表達(dá)水平與患兒的病情嚴(yán)重程度、臨床療效和預(yù)后均密切相關(guān)，臨床可通過檢測(cè)TFRmRNA水平輔助診斷急性白血病、評(píng)估患者病情、評(píng)價(jià)臨床療效和預(yù)測(cè)預(yù)后。