搜風(fēng)順氣丸對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠γδT17的抑制作用

郭肖瑤 底婷婷 趙京霞 王 燕 解欣然 翟春艷 劉正榮，2 蒙玉嬌，2 劉 宇，2 郭簡寧，2 張 璐 王 寧 張 蕾 李 萍*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院 北京市中醫(yī)研究所 銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100010; 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

銀屑病是一種炎性皮膚病。中醫(yī)稱為“白疕”[1]，《醫(yī)宗金鑒》謂白疕“此證俗名蛇風(fēng)，生于皮膚，形如疥疹，色白而癢，搔起白皮。由風(fēng)邪客于肌膚，血燥不能榮養(yǎng)所致”，搜風(fēng)順氣丸可養(yǎng)血潤燥，祛風(fēng)止癢。但目前對于其作用機(jī)制研究較少。本研究進(jìn)一步觀察藥物作用環(huán)節(jié)，并揭示其可能的作用機(jī)制，作為臨床應(yīng)用的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

北京華阜康生物科技股份有限公司，8周齡，雄性，BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量18～20 g，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK(京)2018-006。

1.2 試劑、藥物及儀器

北京同仁堂制風(fēng)順氣丸(Z11020031)，取一顆藥丸溶于13.3 mL雙蒸水中配成溶液備用。按照成人(60 kg)的劑量，根據(jù)人與動物間藥物劑量換算比例換算成小鼠劑量(0.68 g/mL)每日灌胃。四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司制咪喹莫特乳膏，上海信誼藥廠有限公司制甲氨蝶呤片; H2O2去氧離子水; Ki-67單克隆抗體(美國eBioscience公司，160031); CD3一抗工作液(美國Abcam公司); 進(jìn)口山羊血清工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、PCR試劑盒公司(天根生化科技有限公司)等。正置顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)(日本Olympus公司，BX51); 酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，Multiskan Spectrum); 垂直電泳儀(美國BIO-RAD公司，Mini-Protean3); 遠(yuǎn)紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

1.3 動物造模、分組、給藥

動物造模參考Nadeem等[2]銀屑病樣小鼠模型制備方法。戊巴比妥鈉(80 mg/kg)，腹腔注射麻醉，背部備皮 2 cm×3 cm，單籠飼養(yǎng)。對備皮后小鼠采用數(shù)字表法，隨機(jī)分為空白對照組、模型組、搜風(fēng)順氣組及甲氨蝶呤組，每組10只?？瞻捉M小鼠背部每日涂抹等量凡士林，其余小鼠背部每日涂抹5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))咪喹莫特乳膏 62.5 mg。 同時灌胃給藥，1次/d，每次 0.4 mL，連續(xù)6 d。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 皮損病理學(xué)改變、表皮Ki-67表達(dá)及CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤

HE染色觀察皮損改變。并在400倍鏡下測量表皮厚度。免疫熒光染色觀察Ki-67的表達(dá)并在400倍鏡下，在陽性表達(dá)部位隨機(jī)選5個視野，觀察每例標(biāo)本皮膚組織學(xué)改變并記錄陽性細(xì)胞數(shù)量。對皮損CD3+T淋巴細(xì)胞浸潤進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測并計(jì)算數(shù)量。

1.4.2 小鼠脾臟、胸腺、雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)的質(zhì)量

第7天電子天平稱取脾、胸腺、雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)的重量，記錄脾指數(shù)[脾質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g×10)]、胸腺指數(shù)[胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g×10)]、淋巴結(jié)指數(shù)[淋巴結(jié)質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g×10)]并記錄數(shù)據(jù)。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)，胸腺細(xì)胞組成比例

常規(guī)制備組織單細(xì)胞懸液，每1×106細(xì)胞加入100 μL 抗-CD3和 抗-TCR-γ/δ熒光抗體標(biāo)記γδT細(xì)胞，抗-CD3、抗-TCR-γ/δ和 抗-CD3和抗-TCR-RORγ熒光抗體標(biāo)記 RORγt細(xì)胞，常溫避光孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀檢測，F(xiàn)ACSDiva分析。

1.4.4 皮損中STAT3相關(guān)通路蛋白磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(phosphorylated-signal transduction and activators of transcription 3，p-STAT3)表達(dá)的檢測

BCA試劑盒定量背部皮損提取的蛋白。加入p-STAT3及β-actin單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印記分析，計(jì)算灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 搜風(fēng)順氣丸對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型皮損的影響

1)肉眼觀察: 空白對照組小鼠皮膚始終光滑、粉嫩，無任何改變。模型組于第 2～3 天開始出現(xiàn)皮損，背部紅色斑點(diǎn)逐漸從點(diǎn)擴(kuò)大到片狀，鱗屑漸多、浸潤加重，第7天銀屑病樣模型形成。 甲氨蝶呤、搜風(fēng)順氣組皮損與模型組同期相比，小鼠鱗屑明顯變薄、減少，鱗屑厚度減輕，紅斑色淺面積小，皮膚增厚程度輕，浸潤不明顯，皮損癥狀均有所緩解(圖1)。依據(jù)PASI評分可見與模型組相比, 甲氨蝶呤組及搜風(fēng)順氣丸組的鱗屑、浸潤、紅斑及總體評分均有所降低，搜風(fēng)順氣丸組在鱗屑、浸潤方面作用更為顯著(圖2)。

圖1 第7天各組小鼠皮損改變Fig.1 Gross observation of mice on day 7 of treatmentA: control group; B: model group; C: MTX group; D: SFSQ group; MTX: methotrexate; SFSQ: Soufengshunqi decoction.

圖2 咪喹莫特誘導(dǎo)的各組小鼠1～7 d 皮損 PASI 評分趨勢Fig.2 PASI scores of mouse skin lesions induced by imiquimod

2)表皮組織形態(tài)學(xué):空白組表皮層較薄，模型組增厚數(shù)倍，角化不全，角化過度、嚴(yán)重炎性細(xì)胞浸潤，大量基底細(xì)胞核分裂; 甲氨蝶呤、搜風(fēng)順氣組表皮比模型組薄、角化不全細(xì)胞較少，浸潤較輕，基底細(xì)胞核分裂不明顯，搜風(fēng)順氣組改善尤為明顯(圖3)。

圖3 第7天表皮厚度測量及病理改變Fig.3 Histopathological observation of skin lesions on day 7 in each group

2.2 搜風(fēng)順氣丸抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損部位Ki-67陽性表達(dá)

空白組表皮內(nèi) Ki-67 陽性細(xì)胞局限于基底層且數(shù)量較少。 模型組于基底層棘層均大量表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，搜風(fēng)順氣組局限于基底層且減少明顯(P<0.001)(圖4)。

圖4 免疫組織化學(xué)法染色監(jiān)測各組小鼠皮損中 Ki-67 的表達(dá)Fig.4 Ki-67 expression in the skin lesions and the quantitative analysis of the Ki-67 staining positive cell numbers in the skin lesions of each group(IFC staining，400×)A: control group; B: model group; C: MTX group; D: SFSQ group; MTX: methotrexate; SFSQ: Soufengshunqi decoction.

2.3 搜風(fēng)順氣丸抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損中CD3的表達(dá)

空白組皮損真皮 CD3+T細(xì)胞較少，模型組真皮層陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，400倍顯微鏡視野下模型組CD3+T細(xì)胞數(shù)量明顯高于空白組; 甲氨蝶呤組、搜風(fēng)順氣組細(xì)胞數(shù)量均低于模型組(表1，圖5)。

表1 各組7 d 后小鼠皮損中 Ki67、 CD3+ 的表達(dá)Tab.1 Comparison of the number of Ki-67，CD3+in high power microscopic after 7 days (positive cells number)

圖5 免疫組織化學(xué)法染色監(jiān)測各組小鼠皮損中 CD3+ 的表達(dá)Fig.5 CD3+ cells in the skin lesions and the quantitative analysis of CD3+ positive cell numbers in the skin lesions in each group (IHC staining，400×)

2.4 搜風(fēng)順氣丸改善咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠免疫系統(tǒng)異常活化

第7天小鼠脾臟、胸腺、淋巴結(jié)指數(shù)，模型組脾指數(shù)高于空白組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6)，各用藥組脾的質(zhì)量均較模型組低(P<0.001)。模型組淋巴結(jié)指數(shù)高于空白組(P<0.001)，各用藥組均較模型組低，其中搜風(fēng)順氣組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。模型組胸腺指數(shù)高于空白組(P<0.01)。

圖6 第7天小鼠體質(zhì)量、脾及脾指數(shù)、胸腺指數(shù)及雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)指數(shù)Fig.6 Body weight，spleen and spleen index，thymus index and lymph node index on day 7 of each group of mice n=10,*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001 vs model; MTX: methotrexate；SFSQ: Soufengshunqi decoction.

2.5 搜風(fēng)順氣丸對咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠淋巴結(jié)及胸腺CD3+T細(xì)胞的影響作用

各組小鼠雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)CD3+T細(xì)胞中CD4+T比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 淋巴結(jié)γδTCR+比例可見模型組高于空白組且搜風(fēng)順氣組小鼠γδT+比例低于模型組。γδ T+ RORγ T+在小鼠淋巴結(jié) CD3+ T細(xì)胞中模型組表達(dá)明顯高于空白組(P<0.01)，并在搜風(fēng)順氣組中降低。 而γδT+RORγt-在各組中均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖7)。

圖7 各組小鼠雙側(cè)腹股溝淋巴結(jié)及胸腺 CD3+T細(xì)胞中 CD4+T、γδTCR+、γδT+RORγt+、γδT+RORγt-比例分析Fig.7 Analysis of CD4+T，γδTCR+，γδT+ RORγt+，γδT+RORγ T-proportion in lymph nodes and thymus CD3+T cells of each group

各組小鼠胸腺CD3+T細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞比例，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。胸腺γδ T+比例可見模型組高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且搜風(fēng)順氣組小鼠γδ T+比例低于模型組。 γδT+RORγt+在模型組表達(dá)高于空白組，并在搜風(fēng)順氣組中降低。 而γδT+RORγt-在模型組高于空白組且搜風(fēng)順氣組小鼠比例低于模型組 (P<0.01)。

2.6 搜風(fēng)順氣丸抑制咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮損中p-STAT3的表達(dá)

模型組p-STAT3的表達(dá)量高于空白組，相對于模型組，搜風(fēng)順氣組在p-STAT3的表達(dá)較少(P<0.05,圖8)。

圖8 第 7 天小鼠皮損中 p-STAT3蛋白的表達(dá)Fig.8 Expression of p-STAT3 in skin lesionsat day 7 of treatment

3 討論

銀屑病中醫(yī)稱為“白疕”[3]?！夺t(yī)宗金鑒》[4]記載“此證俗名蛇風(fēng)，生于皮膚，形如疥疹，色白而癢，搔起白皮。由風(fēng)邪客于肌膚，血燥不能榮養(yǎng)所致”。風(fēng)邪常兼加他邪，致濕毒、風(fēng)熱、風(fēng)寒等。另外，腸胃無物不受，導(dǎo)致虛形于外熱毒積于中。可見銀屑病以風(fēng)邪血燥為先，而后內(nèi)蘊(yùn)熱毒。因此當(dāng)祛風(fēng)養(yǎng)血潤燥，加以迫腑瀉熱?！夺t(yī)宗金鑒》[4]便首次記載:“治療白疕先以防風(fēng)通圣丸，次服搜風(fēng)順氣丸”。方中補(bǔ)養(yǎng)肝腎精血的牛膝、山萸肉、菟絲子、山藥等借枳殼、檳榔之行氣作用，達(dá)到滋潤肌膚的目的。氣行則血行，血行風(fēng)自滅，故使用枳殼、檳榔行血，順氣破滯寬腸以助火麻仁、郁李仁、大黃滑利潤燥而通幽，而肺與主津液的大腸相表里，由此可借肺氣宣發(fā)以充養(yǎng)肌膚。 防風(fēng)可祛除在上之風(fēng)，獨(dú)活祛除在下之濕，車前子引山藥、牛膝、萸肉、菟絲子入肝腎之經(jīng)[5]。

目前廣泛應(yīng)用的銀屑病研究模型為咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠模型，可快速誘導(dǎo)出與人類銀屑病相似的皮膚表現(xiàn)。觀察皮損改變可見SFSQ組鱗屑薄且少，皮損表現(xiàn)較光滑、柔軟，紅斑色淺、面積小，浸潤程度更輕。小鼠鱗屑、浸潤和紅斑的積分降低，在降低疾病發(fā)展速度、減輕皮損加重程度上，搜風(fēng)順氣丸均有明顯作用。 作為核抗原的 Ki67可反映細(xì)胞增生情況[6-7]，搜風(fēng)順氣丸可以抑制表皮棘細(xì)胞層的異常增生，而不影響基底層細(xì)胞的正常增生。同時減少真皮質(zhì) CD3+ T淋巴細(xì)胞浸潤，抑制T細(xì)胞增生。減輕脾臟及淋巴結(jié)的重量，改善免疫系統(tǒng)的異常活化。

搜風(fēng)順氣丸還可同時降低腹股溝淋巴結(jié)中及胸腺中γδT+RORγt+細(xì)胞比例從而抑制 IL-17的產(chǎn)生。作為胞質(zhì)蛋白家族[8]，STATs參與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。 STAT3通路可調(diào)控產(chǎn)生IL-17的細(xì)胞分化與分泌[10-11]。 銀屑病患者皮損中 STAT3 處于高表達(dá)狀態(tài)[12-13]。搜風(fēng)順氣丸可減少 p-STAT3蛋白的表達(dá)含量，抑制 STAT3通路的異?；罨档?IL-17類細(xì)胞因子的分泌，從而抑制銀屑病炎性反應(yīng)狀態(tài)。

本次研究中通過銀屑病樣小鼠模型的建立，觀察到皮損部位的減輕改變，減少γδT細(xì)胞，尤其是γδT17在胸腺組織中的浸潤比例，同時還可以抑制 STAT3通路的磷酸化，降低 IL-17類細(xì)胞因子的分泌以減輕免疫反應(yīng)。作為臨床治療銀屑病常用的免疫抑制劑，甲氨蝶呤可改善患者癥狀，但具有長期服用安全性較差、易引起不良反應(yīng)導(dǎo)致病情惡化的缺點(diǎn)。針對銀屑病病因未完全明確、無特效藥物的現(xiàn)狀，復(fù)方中藥因臨床療效確切且不良反應(yīng)少成為研究熱點(diǎn)，具體作用機(jī)制亟待深入探索。以上研究為中醫(yī)藥臨床治療提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)，并為方劑的優(yōu)化提供方向。