MDCK懸浮細胞制備及流感病毒敏感性研究

李自良，王家敏，趙彩紅，王美皓，李 莉，張雪梅，李 倬，靳冬武，馬忠仁，喬自林

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1細胞 貼壁培養(yǎng)型MDCK細胞：從ATCC引進，引進后由甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心按《中國藥典》2010版的要求建立主細胞庫(MDCK-M-60，P60)和工作細胞庫(MDCK-W-63，P63)；用含10%FBS(V/V)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

懸浮培養(yǎng)型MDCK細胞：本課題組自主馴化、凍存，并命名為MDCK-XF02細胞；用MDCK-SFM-(CFM-402)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.2病毒 疫苗生產(chǎn)用流感病毒：A/California/7/2009 X-179A(H1N1)；A/Texas/50/2012 X-223A(H3N2)；B/Phuket/3073/2013(B/P)；B/Brisbane/60/2008( BX-35)；疫苗生產(chǎn)用禽流感病毒：H5亞型Re-5、H5亞型Re-6、H5亞型Re-10。

1.1.3培養(yǎng)基與血清 DEME(high-glucous)培養(yǎng)基：購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司；血清(FBS)：購自蘭州民海生物工程有限公司；MDCK-SFM-(CFM-402)無血清培養(yǎng)基：購自蘭州百靈生物技術(shù)有限公司。

1.1.4主要試劑與儀器 TrypLE 胰蛋白酶替代物(1X)，貨號：12563-029，購自Gibco公司。0.2%臺盼藍，購自Sigma公司；二甲基亞砜(Thermo Scientific)；TPCK-胰蛋白酶，購自Sigma公司。

CKX-41型生微倒置顯微鏡(Olympus)、3111型CO2培養(yǎng)箱(ThermoFisher)、IC1000細胞計數(shù)儀(Countstar)，ZCZY-AS8型震蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器)、BioFlo 320型5L生物反應(yīng)器(Eppendorf)。

1.2 方 法

1.2.1MDCK細胞低血清適應(yīng)培養(yǎng)和馴化 用含10%FBS(V/V，下同)的DMEM培養(yǎng)基復(fù)蘇貼壁培養(yǎng)型MDCK細胞(MDCK-W-63)，待細胞長滿單層后，用0.25%胰蛋白酶(m/m)消化分散細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)型MDCK細胞每傳代培養(yǎng)兩代培養(yǎng)基中FBS濃度降低1%，至最終培養(yǎng)基中的FBS濃度為1%。

1.2.2MDCK細胞無血清懸浮培養(yǎng)和馴化 從血清濃度降到1%適應(yīng)傳代培養(yǎng)兩代后，消化液由胰蛋白酶換為TrypLE胰蛋白酶替代物，并逐步減少DMEM的量(含1%FBS)，逐步增加無血清培養(yǎng)基的量，培養(yǎng)基中的DMEM的量(含1%FBS)組分比例降低為20%再繼續(xù)傳代培養(yǎng)兩代。之后傳代培養(yǎng)時開始擴大細胞培養(yǎng)，細胞總數(shù)達2.0×108cells以上時，消化離心后用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為3.0×106cells/mL，取50 mL細胞懸液用150 mL錐形瓶在37 ℃、5%CO2和110 r/min搖床懸浮培養(yǎng)，每天離心更換無血清培養(yǎng)基1次。待懸浮培養(yǎng)MDCK細胞的活細胞密度達6.0×106cells/mL以上時離心后按2.0×106cells/mL密度分瓶培養(yǎng)，以此連續(xù)傳代，每分瓶培養(yǎng)1次記為一次傳代培養(yǎng)。

1.2.3MDCK-XF02細胞的凍存、復(fù)蘇與活率檢測 常規(guī)方法凍存、復(fù)蘇并檢測細胞活率[14]。

1.2.4MDCK-XF02細胞生長曲線繪制、生長動力學(xué)分析及連續(xù)傳代穩(wěn)定性驗證 MDCK-XF02細胞復(fù)蘇培養(yǎng)3代后，以不同密度接種，置搖床(37 ℃、5% CO2、110 r/min)懸浮培養(yǎng)，每個接種密度平行3組，每12 h取樣計數(shù)，繪制細胞生長曲線。并比較不同密度接種培養(yǎng)MDCK-XF02細胞的最大増殖密度、倍增時間[15]、比生長速率[16]。并以最佳接種密度接種連續(xù)傳代培養(yǎng)10代，平行3組，每24 h取樣計數(shù)，繪制細胞生長曲線。

倍增時間=T/A，A=log2(Y/X)

X為初始接種細胞數(shù)，Y為細胞最大増殖密度前一天的細胞數(shù)，T為培養(yǎng)時間。

比生長速率=(lnXn/Xn-1)/(tn-tn-1)

X為活細胞密度，t為培養(yǎng)時間，n和n-1為2個取樣計數(shù)時間點。

1.2.55L生物反應(yīng)器放大培養(yǎng) 將傳代培養(yǎng)至不同代次的MDCK-XF02細胞按最佳接種密度接種于5 L生物反應(yīng)器，設(shè)定培養(yǎng)參數(shù)，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速120 r/min，pH 7.2，Do(Dissolved oxygen) 40%，通氣量0.002-1 VVM(Air Volume/culture volume)/min。每24 h取樣計數(shù)，繪制細胞生長曲線。比較最大増殖密度、倍增時間、比生長速率。

1.2.6MDCK-XF02細胞增殖流感和禽流感病毒敏感性研究 MDCK-XF02細胞生長至密度(8.0～10.0)×106cells/mL時，用無血清培養(yǎng)基稀釋至密度為(4.0～5.0)×106cells/mL，按病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)0.01接種四種型別的流感病毒和三種型別的禽流感病毒并添加2.5 μg/mL TPCK胰蛋白酶，每種病毒平行3組，置于34 ℃、5% CO2、110 r/min培養(yǎng)。病毒接種24 h、36 h、48 h、60 h測定血凝效價(HA)和半數(shù)細胞感染量(CCID50)，拍照觀察細胞形態(tài)和病變程度，并繪制不同時間HA、CCID50圖。

2 結(jié) 果

2.1MDCK細胞低血清適應(yīng)培養(yǎng)和馴化 貼壁培養(yǎng)型MDCK細胞(MDCK-W-63)逐步降低培養(yǎng)基中胎牛血清濃度，(從P64代傳代培養(yǎng)至P83代，共計連續(xù)低血清適應(yīng)培養(yǎng)20代。因降低FBS濃度使細胞生長速度變慢，傳代比例也相應(yīng)降低。其中P64-P69代以1∶6的比例傳代培養(yǎng)；P70-P75代以1∶5的比例傳代培養(yǎng)；P76-P83代以1∶4的比例傳代培養(yǎng)。)至P83代時已適應(yīng)了1%FBS培養(yǎng)，按1∶4比例傳代培養(yǎng)時，48 h仍可生長成單層細胞，細胞形態(tài)與10%FBS培養(yǎng)時相似，但細胞長成單層時相互擠壓或重疊現(xiàn)象不如10%FBS培養(yǎng)時明顯。如圖1A和1B所示。

圖1 馴化前后MDCK細胞形態(tài)對比(A:10%FBS，B:1%FBS，C:MDCK-XF02)Fig.1 Morphological comparison of MDCK cells before and after domestication

2.2MDCK細胞無血清懸浮培養(yǎng)和馴化 血清濃度降到1%適應(yīng)傳代培養(yǎng)兩代后(P82、P83代)，從P84代傳代培養(yǎng)至P98代，共計連續(xù)無血清懸浮馴化培養(yǎng)15代。至P96代傳代時開始擴大細胞培養(yǎng)量，至P98時細胞總數(shù)達2.0×108個以上，消化離心后全用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為3.0×106cells/mL。至P99代時細胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)，在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)活力高、結(jié)團少、均一性好，經(jīng)6次換液后基本適應(yīng)了懸浮條件下培養(yǎng)，細胞生長速度變快，第9次換液后培養(yǎng)24 h，細胞密度達6.3×106cells/mL。懸浮培養(yǎng)的MDCK細胞(P99代)第一次傳代后以2.0×106cells/mL接種培養(yǎng)生長速度逐步加快，如圖2所示。

圖2 懸浮培養(yǎng)型MDCK細胞(P100-P103代)生長密度Fig.2 Growth density of suspension cultured MDCK cells (P100-P103 generation)

2.3MDCK-XF02細胞的凍存、復(fù)蘇和活力檢測結(jié)果 懸浮培養(yǎng)的MDCK細胞無血清傳代培養(yǎng)至P103代時凍存300支，凍存密度為5.4×107cells/mL，細胞活力為92.15%，將馴化的懸浮培養(yǎng)型MDCK細胞株命名為：MDCK-XF02。凍存的MDCK-XF02細胞復(fù)蘇活力達91.22%，復(fù)蘇后細胞形態(tài)呈圓形，細胞邊緣整齊，大小較均一，如圖1C所示。

2.4MDCK-XF02細胞生長曲線繪制、生長動力學(xué)分析及傳代穩(wěn)定性驗證 MDCK-XF02細胞復(fù)蘇培養(yǎng)3代后，以0.5×106cells/mL、1.0×106cells/mL、1.5×106cells/mL、2.0×106cells/mL、3.0×106cells/mL的密度接種培養(yǎng)，細胞生長均快，生長曲線成近“S”型，如圖3所示。細胞經(jīng)過12 h的潛伏期，此后迅速進入對數(shù)生長期，不同密度接種平臺期維持時間不同，之后細胞密度迅速下降，進入衰亡期。

比生長速率如圖3所示，分別為(0.034±0.011)h-1、(0.025±0.022)h-1、(0.022±0.02)h-1、(0.019±0.020)h-1、(0.016±0.025)h-1。不同接種密度培養(yǎng)MDCK-XF02細胞均在36 h時達到最大比生長速率，最大比生長速率分別為(0.056±0.007)h-1、(0.056±0.019)h-1、(0.056±0.009)h-1、(0.047±0.007)h-1、(0.055±0.008)h-1。隨后比生長速率迅速下降，在60 h時3.0×106cells/mL的密度接種培養(yǎng)的MDCK-XF02細胞比生長速率已降低為(-0.002±0.005)h-1。

最大增殖密度如圖4所示，不同密度接種培養(yǎng)MDCK-XF02細胞的最大增殖密度分別為(13.40±0.70)×106cells/mL、(13.17±1.36)×106cells/mL、(13.67±0.76)×106cells/mL、(14.03±1.19)×106cells/mL、(13.93±0.55)×106cells/mL。比較發(fā)現(xiàn)不同密度接種培養(yǎng)MDCK-XF02細胞的最大增殖密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

倍增時間如圖4所示，分別為(18.96±0.35)h、(20.04±0.56)h、(20.25±1.30)h、(22.29±0.30)h、(21.40±0.83)h。不同密度接種培養(yǎng)MDCK-XF02細胞的倍增時間隨著接種密度的增大逐漸增加，接種密度高低會直接影響細胞的生長周期，接種密度過高導(dǎo)致細胞快速達到最大增值密度，大量細胞代謝副產(chǎn)物極劇增加，迅速進入衰亡期。接種密度過低會導(dǎo)致培養(yǎng)時間增加，大大增加了生產(chǎn)成本和污染風(fēng)險。選擇合適倍增時間不僅有利于細胞最佳的生長狀態(tài)也有利于生產(chǎn)實際結(jié)合，降低生產(chǎn)成本。

圖3 不同接種密度培養(yǎng)MDCK-XF02細胞生長曲線和比生長速率Fig.3 Growth curve and specific growth rate of MDCK-XF02 cells inoculated with different densities

圖4 不同接種密度培養(yǎng)MDCK-XF02細胞最大增殖密度和倍增時間Fig.4 Maximum proliferation density and doubling time of MDCK-XF02 cells cultured in different densities

傳代穩(wěn)定性如圖5所示，以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種后生長48 h細胞密度均能達到(11.08±0.24)×106cells/mL，在連續(xù)傳代培養(yǎng)的過程中細胞形態(tài)和生長狀況接近一致，P110-P120代MDCK-XF02細胞的比生長速率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 MDCK-XF02細胞傳代穩(wěn)定性Fig.5 MDCK-XF02 cell passage stability

綜合以上對MDCK-XF02細胞株不同接種密度培養(yǎng)生長曲線繪制及生長動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種培養(yǎng)效果最佳，不僅有利于細胞最佳的生長狀態(tài)也有利于生產(chǎn)實際結(jié)合，降低生產(chǎn)成本；連續(xù)傳代培養(yǎng)結(jié)果說明，在無血清懸浮培養(yǎng)基中MDCK-XF02細胞能連續(xù)傳代培養(yǎng)且生長動力學(xué)較穩(wěn)定；從病毒擴增和疫苗生產(chǎn)方面來說，以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種有利于更好的控制細胞代謝產(chǎn)物和穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，從而使得單位細胞病毒產(chǎn)率達到最大。當(dāng)然，對單位細胞病毒產(chǎn)率的影響因素還有許多，但就從細胞接種密度的選擇上，MDCK-XF02細胞株以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種最佳。

2.55L反應(yīng)器放大培養(yǎng) MDCK-XF02細胞傳代至P110、P120、p130代按2.0×106cells/mL接種于5L生物反應(yīng)器，細胞生長狀態(tài)良好，大小均一。細胞生長曲線如圖6所示，從圖中可以看出生長曲線近呈“S”型，培養(yǎng)至72 h時細胞密度達到最大值：比生長速率分別為(0.027±0.012)h-1、(0.028±0.013)h-1、(0.028±0.013)h-1差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，如圖6。倍增時間、最大増殖密度結(jié)果見表1；結(jié)果顯示，線性放大過程中，MDCK-XF02細胞生長動力學(xué)較穩(wěn)定。

圖6 5L生物反應(yīng)器培養(yǎng)不同代次MDCK-XF02細胞生長曲線和比生長速率Fig.6 Growth curve and specific growth rate of different generations of MDCK-XF02 cells cultured in 5L bioreactor

表1 5L生物反應(yīng)器培養(yǎng)不同代次MDCK-XF02細胞倍增時間和最大增殖密度

Tab.1 doubling time and maximum proliferation density of different generations of MDCK-XF02 cells cultured in 5L bioreactor

Cell generationP110P120P130Multiplication time/h20.46±0.6519.94±0.3720.02±0.17Maximum proliferation concentra-tion(×106 cells/mL)13.97±0.3214.57±0.4714.40±0.19

2.6MDCK-XF02細胞增殖流感和禽流感病毒敏感性研究 MDCK細胞目前應(yīng)用最廣泛的流感研究細胞系之一，然而，MDCK細胞對不同流感和禽流感病毒株的敏感性并不相同，病毒的增殖效率也受到限制。值得關(guān)注的是，MDCK-XF02細胞增殖流感和禽流感病毒動力學(xué)顯示，在感染后36～48 h達到最大滴度，允許在早期收獲，從而從一定程度上減輕了下游純化工藝的難度。流感病毒B/P在36 h達到最大病毒顆粒釋放量的特異性生產(chǎn)動力學(xué)。我們的研究結(jié)果表明，MDCK-XF02細胞系是一個非常有應(yīng)用價值的工業(yè)化生產(chǎn)流感和禽流感疫苗的細胞株。

2.6.1流感病毒敏感性 不同時間HA、CCID50見圖7，MDCK-XF02細胞接種H1N1和H3N2均能很好的生長，培養(yǎng)24 h HA效價(log2HA/25 μL)為4～5、CCID50為(2.27～2.59)lgCCID50/mL，60 h時 HA效價(log2HA/25 μL)為6～7、CCID50為(4.35～4.68)lgCCID50/mL；接種流感病毒B/P和BX-35增殖更快，36 h HA效價(log2HA/25 μL)均為8、CCID50分別為7.31lgCCID50/mL、5.53lgCCID50/mL，60 h時HA效價(log2HA/25 μL)達到9～10，CCID50分別為6.14lgCCID50/mL、6.38lgCCID50/mL。

如圖8所示，接毒后24 h細胞出現(xiàn)皺縮，結(jié)團現(xiàn)象，36 h時細胞大量結(jié)團，生長停滯。48～60 h細胞開始崩解、出現(xiàn)大量細胞碎片。接種不同型別的流感病毒其病變過程相似，但病變程度強弱有差異。

2.6.2禽流感病毒敏感性 懸浮培養(yǎng)型MDCK-XF02細胞接種重組禽流感病毒H5亞型Re-5、H5亞型Re-6、H5亞型Re-10均能很好的生長，培養(yǎng)24 h HA效價(log2HA/25 μL)為4～5、CCID50為(4.11～4.37)lgCCID50/mL，60 h時HA效價(log2HA/25 μL)為7～9、CCID50達到(6.21～6.96)lgCCID50/mL；不同時間HA、CCID50見圖9。

圖7 MDCK-XF02細胞株增殖流感感病毒的HA和CCID50Fig.7 MDCK-XF02 cell line proliferating influenza virus HA and CCID50

圖8 病毒致MDCK-XF02細胞病變(A: 0 h, B: 12 h, C: 24 h, D: 36 h, E: 48 h, F: 60 h)Fig.8 Cytopathic effect of MDCK-XF02 (A: 0 h, B: 12 h, C: 24 h, D: 36 h, E: 48 h, F: 60 h)

圖9 MDCK-XF02細胞株增殖禽流感病毒的HA和CCID50Fig.9 MDCK-XF02 cell line proliferating avian influenza virus HA and CCID50

3 討 論

MDCK細胞為貼壁培養(yǎng)型細胞，需要添加血清才能正常生長。無血清懸浮培養(yǎng)工藝的難點是將原始的含血清貼壁培養(yǎng)型細胞系馴化為無血清懸浮培養(yǎng)型細胞株；本研究首先對ATCC引進的貼壁培養(yǎng)型MDCK細胞系通過低血清適應(yīng)培養(yǎng)和馴化至最終培養(yǎng)基中的FBS濃度由10%降為1%，后用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)和馴化，最終成功得到了一株新型的無血清懸浮培養(yǎng)型MDCK-XF02細胞株，進一步從搖瓶擴大至生物反應(yīng)器培養(yǎng)。并用MDCK-XF02細胞株作為底物接種四種型別的流感病毒和3種型別的禽流感病毒，初步研究了該細胞株對流感和禽流感病毒的增值特性。從搖瓶懸浮培養(yǎng)擴大至5L生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程中MDCK-XF02細胞的生長曲線繪制及生長動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，接種密度高低會直接影響細胞的生長周期，以(1.0～2.0)×106cells/mL細胞密度接種培養(yǎng)效果最佳。MDCK-XF02細胞株作為底物接種流感病毒和禽流感病毒的初步應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，該細胞株能夠增殖流感和禽流感病毒且增殖效果好。

細胞培養(yǎng)是目前公認的最經(jīng)濟、快速和安全的病毒增殖方法。近年來，生物反應(yīng)器大規(guī)模細胞技術(shù)的快速發(fā)展，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶和細胞工廠培養(yǎng)相比表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢，用生物反應(yīng)器培養(yǎng)細胞和增殖病毒已成為疫苗生產(chǎn)工藝的首選。無論是微載體培養(yǎng)、片狀載體培養(yǎng)，還是低血清懸浮培養(yǎng)，因培養(yǎng)基中含有動物來源的血清成份對疫苗接種者有副反應(yīng)和其它安全風(fēng)險，所以，無血清懸浮培養(yǎng)是疫苗生產(chǎn)最青睞的工藝，而且還可以線性放大，應(yīng)用價值巨大，對流感疫苗和禽流感疫苗的工業(yè)生產(chǎn)意義重大[17]。

利益沖突：無