黑水虻蟲卵冷藏保存技術研究

王鳳英 ，肖乾鵬，王 星

（1.廣州安芮潔環(huán)保科技有限公司，廣東 廣州 510450；2.湖南農業(yè)大學植物保護學院，湖南 長沙 410128）

【研究意義】黑水虻Hermetia illucensL.隸屬雙翅目Diptera水虻科Stratiomyidae扁角水虻屬Hermetia，又名亮斑扁角水虻?？赏ㄟ^取食有機廢棄物產出新型動物飼料及有機肥，是當前研究較多的一種資源昆蟲[1-5]。國內外學者對黑水虻幼蟲和成蟲的生物學特性進行了較多研究[6-8]，但關于冷藏黑水虻蟲卵的報道甚少?！厩叭搜芯窟M展】Holmes等對蟲卵孵化的發(fā)育起始溫度進行研究，認為黑水虻卵發(fā)育的起始溫度在 12～16 ℃[9]。Shaphan等在研究溫度和飲食對黑水虻生長發(fā)育的影響中發(fā)現(xiàn)：10 ℃時，蟲卵無法孵化；15 ℃冷藏14 d，蟲卵孵化率為10.6%（±2.1）%；20 ℃冷藏8 d，孵化率為59%（±10.6）%，冷藏效果不理想[10]?！颈狙芯壳腥朦c】我們認為蟲卵冷藏后無法順利孵化的原因有以下幾點：一是冷藏溫度低于蟲卵發(fā)育起始溫度，同時未采用正確手段使蟲卵休眠或滯育，蟲卵死亡；二是冷藏過程中濕度不適宜，低溫環(huán)境中，空氣中水分低，蟲卵易脫水死亡，而濕度過高時，水汽在蟲卵表面凝結，蟲卵死亡；三是蟲卵儲存的營養(yǎng)物質在冷藏過程中消耗過快，無法支撐蟲卵正常孵化；四是基于Mazur提出低溫對卵的傷害隨卵的發(fā)育而減輕的觀點[11]，推測不同發(fā)育階段的蟲卵對低溫的耐受性不同?！緮M解決的關鍵問題】綜合以上4點考慮，為提高冷藏蟲卵的孵化率，本試驗將黑水虻卵發(fā)育劃分為卵裂期、胚盤胚帶形成期、原腸形成期、胚體分節(jié)期、破殼期（因體壁形成期與器官形成期發(fā)育時間交叉，故本研究統(tǒng)一為破殼期）5個時期，并將5個發(fā)育時期的蟲卵分別在溫度為12 ℃、濕度為80%環(huán)境中進行冷藏。姬越等研究了黑水虻發(fā)育的適宜溫度，認為黑水虻孵化的最佳溫度為32℃，此溫度下孵化歷期最短、初孵幼蟲最多[8]。參照其研究結論，本實驗將冷藏過后的蟲卵轉置于32 ℃的環(huán)境中孵化，以蟲卵孵化80%為基準線驗證發(fā)育階段對蟲卵冷藏后孵化率及幼蟲生長發(fā)育的影響，以期為黑水虻規(guī)?；a苗種培育環(huán)節(jié)提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲卵 黑水虻蟲卵由廣州安芮潔環(huán)保科技有限公司提供。幼蟲取食餐廚垃圾，飼養(yǎng)溫度為30（±2） ℃。成蟲飼養(yǎng)溫度為28 （±3）℃，相對濕度為50%～90%，自然光照。待成蟲交配，采集集卵板上的初產卵塊，卵塊的產卵間期不超過2 h。試驗于2018年6月至2019年3月在廣州安芮潔環(huán)?？萍加邢薰緦嶒炇疫M行。

1.1.2 幼蟲飼料 初孵幼蟲取食含水量70%的麩皮，5～15日齡幼蟲取食含水量75%的餐廚漿料。幼蟲飼料及試養(yǎng)方法由廣州安芮潔環(huán)?？萍加邢薰咎峁?。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑水虻蟲卵胚胎發(fā)育期 參照莫文艷等的方法，單克初產蟲卵采用41 000個卵粒進行養(yǎng)殖參數(shù)計算。黑水虻蟲卵在32 ℃氣候箱（寧波賽福實驗儀器有限公司，PRX-350B）發(fā)育8.5 h形成“瓶”狀的胚帶，發(fā)育13 h為原腸形成期，發(fā)育30 h體壁開始背合，48 h后為破殼期。

1.2.2 蟲卵冷藏與孵化 收集產卵時間相差不超過2 h的蟲卵9 g，用分析天平稱量18份0.5 g的樣品平鋪（鋪放厚度不高于3 mm）在小培養(yǎng)皿內，試驗設冷藏初產蟲卵、冷藏胚盤胚帶形成期蟲卵、冷藏原腸期蟲卵、冷藏體壁背合期蟲卵、冷藏破殼期蟲卵、32℃直接孵化的初產蟲卵（對照）6個處理，分別記為A、B、C、D、E、CK，每個處理3次重復。除處理A外，其余處理均置于孵化氣候箱（32℃，RH 80%，光周期14L∶10D）保存。隨后立即對處理A進行鏡檢，記錄蟲卵發(fā)育階段和存活率后放置到冷藏氣候箱。隔6 h，從孵化氣候箱取出處理B鏡檢；隔13 h取出處理C鏡檢；隔30 h取出處理D鏡檢；隔40 h取出處理E鏡檢，各自鏡檢完畢后均放置到12℃冷藏氣候箱保存。對照一直置于32℃的孵化氣候箱，直至自然孵化。對放進冷藏氣候箱冷藏的各處理，每隔24 h，隨機取樣置于載玻片上，每個載玻片上100個蟲卵，3次重復，將載玻片放入孵化氣候箱進行孵化，每天鏡檢發(fā)育情況，利用顯微鏡計數(shù)未孵化卵數(shù)（D），計算孵化率（S），直至孵化率低于80%。

1.2.3 原腸期卵冷藏處理及初孵幼蟲總重測定 在12個直徑為10 cm的孔徑0.180 mm分級篩上分別稱量1 g初產蟲卵置于孵化氣候箱，發(fā)育到原腸期后轉移到冷藏氣候箱分別冷藏0、5、10、15 d（4個處理，每個處理3次重復），而后轉移回到孵化氣候箱。將分級篩放在直徑為15 cm的培養(yǎng)皿內，培養(yǎng)皿內部四周邊緣均勻撒3 g玉米粉。待幼蟲孵化后，稱量初孵幼蟲和玉米粉的總質量，計算初孵幼蟲質量。然后將初孵幼蟲和玉米粉一起撒到250 g含水量70%的麩皮上方（麩皮厚度約10 cm，置于容器中部，容器為40 cm×60 cm×10 cm的塑料盒），并用勺子輕輕撥開初孵幼蟲，避免玉米粉結球發(fā)粘導致幼蟲死亡。

1.2.4 不同冷藏時間原腸期卵5日齡幼蟲存活率 養(yǎng)殖5 d，幼蟲取食完開口料后，利用幼蟲避光的習性，將堆積在幼蟲表面的麩皮殘渣輕輕抹去，直至只剩幼蟲。然后將麩皮殘渣放在孔徑0.250 mm篩網(wǎng)上，篩網(wǎng)放在陽光下，讓殘渣內殘留的極少量幼蟲掉落到篩網(wǎng)下方的培養(yǎng)皿內。將收集到的幼蟲稱量總重，隨機取樣3個，用分析天平稱量并記錄重量（每個樣品重量約0.1 g），計數(shù)幼蟲數(shù)量，計算5日齡幼蟲存活率：

1.2.5 冷藏5、10、15 d原腸期卵15日齡幼蟲存活率和幼蟲重量 初孵幼蟲在麩皮中取食5 d將幼蟲輕輕篩出并轉移到1 kg含水量70%的餐廚漿料（漿料厚度約3 cm，置于容器中部，容器為50 cm×50 cm×15 cm的面包框內裝著0.180 mm孔徑的紗網(wǎng)網(wǎng)兜）上飼養(yǎng)。漿料視取食情況進行補料，當新鮮漿料都變成灰褐色時再補1 kg，養(yǎng)殖過程中，各處理合計投喂?jié){料16 kg。幼蟲13日齡時停止補料進行饑餓處理，幼蟲15日齡時用孔徑0.425 mm篩將幼蟲與殘渣分離，稱量總重后，隨機取 100 頭進行稱重，計算單頭幼蟲平均體重（稱量后放回飼養(yǎng)盒）。計算幼蟲養(yǎng)殖存活率：

試驗數(shù)據(jù)采用LSD多重比較進行方差分析，采用Excel繪圖。

2 結果與分析

2.1 冷藏時間對不同發(fā)育階段黑水虻蟲卵孵化率的影響

從圖1可以看出，冷藏時間對不同發(fā)育階段黑水虻蟲卵孵化率具有顯著影響，初產蟲卵（處理A）不能直接冷藏，冷藏1 d死亡率達100%。破殼期卵（處理E）不適于冷藏，冷藏3 d后幼蟲無法破殼。原腸期卵（處理C）孵化率＞80%的冷藏周期為15 d，顯著大于體壁背合期卵（處理D）的6 d和胚盤胚帶形成期卵（處理B）的13 d，故原腸期卵是較適合的冷藏階段。

圖1 冷藏時間對不同發(fā)育階段黑水虻蟲卵孵化率的影響Fig.1 Effects of cold storage time on hatching rate of Hermetia illucens at different developmental stages

2.2 原腸期蟲卵不同冷藏時間對黑水虻生長發(fā)育的影響

2.2.1 原腸期不同冷藏時間對黑水虻不同時期幼蟲生長發(fā)育的影響 隨著冷藏時間拉長，部分初孵幼蟲由于活力不足，無法順利從紗網(wǎng)掉落到盆內。稱量初孵幼蟲質量可以從側面反映蟲卵的有效孵化率。冷藏15 d卵的初孵幼蟲質量顯著低于對照（P=2.82e-6），詳見表1。

2.2.2 原腸期不同冷藏時間對黑水虻5日齡幼蟲生長發(fā)育的影響 各處理初孵幼蟲養(yǎng)殖5 d后，篩分稱量總重、百頭重，計算冷藏0、5、10、15 d卵的5日齡幼蟲存活率。結果（表1）顯示各處理5日齡幼蟲百頭重無顯著差異（P=0.434），冷藏15 d的5日齡幼蟲存活率顯著低于對照（P=6.1e-7）。

2.2.3 原腸期不同冷藏時間對黑水虻15日齡幼蟲生長發(fā)育的影響 將各處理收獲的5日齡幼蟲繼續(xù)養(yǎng)殖10 d后，篩分稱量總重、百頭重，計算15日齡幼蟲養(yǎng)殖存活率（此處的養(yǎng)殖存活率以5日齡幼蟲數(shù)為基數(shù)而非蟲卵數(shù)），結果（表1）顯示各處理15日齡幼蟲百頭重無顯著差異（P=0.187），冷藏15 d的15日齡幼蟲存活率顯著低于對照（P=0.024）。

表1 冷藏時間對黑水虻不同階段幼蟲生長發(fā)育的影響Table 1 Effects of cold storage time on growth and development of Hermetia illucens larvae at different developmental stages

3 討論

黑水虻卵冷藏過程中，初產蟲卵無法發(fā)育直接死亡，可能是因為初產蟲卵的發(fā)育起始溫度高于12 ℃。Holmes等研究認為黑水虻卵發(fā)育的起始溫度在12～16 ℃[9]，然而其研究報道中未說明蟲卵進入冷藏階段時的發(fā)育情況，故我們推測初產蟲卵的發(fā)育起始溫度高于12 ℃。

黑水虻其他幾個發(fā)育階段的蟲卵經(jīng)12 ℃冷藏后，均能在32 ℃發(fā)育成幼蟲。但隨著冷藏時間推移，幼蟲無法正常破殼，死于卵殼內。我們在研究黑水虻卵胚胎發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)冷藏的蟲卵表面有一層粘液，正常發(fā)育的胚胎出殼前尾部會分泌一種疑似具有溶解卵殼功能的液體，幼蟲通過蠕動身體把部分液體擠到頭頂，利用口器持續(xù)頂頭頂卵殼，直到出現(xiàn)裂縫，幼蟲從卵殼中爬出。而冷藏過后的蟲卵，表面粘液消失，在孵化時，未見尾部分泌液體，可能是黑水虻卵冷藏過程中失水所致。

黑水虻卵是一個大細胞，最外層為卵殼，卵殼下方為卵黃膜。卵殼或卵殼與卵黃膜間形成蠟質層，卵殼與蠟質層起到保護卵、防止卵內水分過量蒸發(fā)和阻止水溶性物質自由進出的卵的作用[12]。我們曾在空氣濕度約50%，通風優(yōu)良的環(huán)境中孵化蟲卵，發(fā)現(xiàn)孵化率極低，蟲卵死亡狀態(tài)與蟲卵冷藏時的死亡狀態(tài)類似，懷疑蟲卵冷藏過程中，卵殼或蠟質層受損，卵內水分大量蒸發(fā)，導致幼蟲無法正常破殼。我們后續(xù)加大冷藏濕度（90%）進行試驗，冷藏效果不理想，蟲卵表面易著落凝結的水珠，卵孵化率低。推想如果要進一步增加蟲卵冷藏間期，需要從蟲卵保濕以及種蟲養(yǎng)殖繁育時補充營養(yǎng)等方面著手。

蟲卵冷藏對幼蟲的發(fā)育造成一定的影響，隨著冷藏時間增長，孵化歷期加長，初孵幼蟲活力變差甚至無法破殼，這使得后期養(yǎng)殖過程中，經(jīng)冷藏處理的幼蟲發(fā)育相對對照不整齊，這個現(xiàn)象在冷藏15 d時非常明顯。發(fā)育不整齊的幼蟲不適宜養(yǎng)殖為蛹用于繁育，故本實驗未繼續(xù)作成蟲繁育方面的研究，如果冷藏技術有新進展，不再影響幼蟲發(fā)育的整齊度，有待進行冷藏卵的成蟲繁育方面研究。

從原腸期卵分別冷藏0、5、10、15 d對黑水虻生長發(fā)育的影響結果中可以看出，各處理均存在蟲卵孵化率高、初孵幼蟲（1～5日齡）存活率低和幼蟲（5～15日齡）養(yǎng)殖存活率高的規(guī)律，與姬越等的報道相似[8]。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，孵化環(huán)境溫濕度、蟲卵鋪放厚度、飼料表面明水量、飼料透氣性等因素都對初孵幼蟲存活率具有較大影響，更全面的了解初孵幼蟲存活率的影響因素，提升初孵幼蟲存活率是黑水虻規(guī)?；B(yǎng)殖關鍵技術的研究重點之一。

4 結論

在溫度為12 ℃、濕度為80 %的冷藏環(huán)境，經(jīng)冷藏后的初產蟲卵、體壁背合期和破殼期蟲卵發(fā)育受阻，孵化率降低；胚盤胚帶形成期蟲卵冷藏13 d內孵化率＞80%；原腸期的黑水虻卵冷藏15 d內能保持＞80%的孵化率，孵化出來的幼蟲生長發(fā)育正常，冷藏超過15 d，孵化率顯著降低，無法正常破殼。所以不同發(fā)育階段的蟲卵對低溫的耐受性不同，低溫對卵的傷害會隨卵的發(fā)育而減輕，冷藏即將發(fā)育完全或已經(jīng)發(fā)育完全的胚胎，胚胎無法正常破殼。