巴氏殺菌乳風(fēng)味品質(zhì)及殘留微生物測定研究進(jìn)展

楊姍姍，丁瑞雪，劉語萌，孫雪婷，岳喜慶，武俊瑞*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

牛乳因其營養(yǎng)成分豐富且比例適合、營養(yǎng)成分吸收率高等特點，被公認(rèn)為理想的營養(yǎng)食品[1-2]。隨著生活質(zhì)量的提高，人們對于乳品的需求出現(xiàn)逐年上升趨勢。與其他殺菌方法相比，巴氏殺菌既能有效地殺死牛乳中的致病菌，又能很好地保留有益人體的各種營養(yǎng)物質(zhì)[3-4]，因此巴氏殺菌乳深受消費者青睞。

隨著風(fēng)味檢測技術(shù)及高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，這些技術(shù)越來越多地應(yīng)用到乳品領(lǐng)域。與傳統(tǒng)風(fēng)味檢測技術(shù)相比，電子鼻、電子舌、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）等新型測定方法不僅可以快速分離出樣品中的化合物信號，同時還可以通過保留指數(shù)定性給出許多未知化合物的風(fēng)味信息，有利于進(jìn)一步對其性質(zhì)進(jìn)行深入探討和研究[5]。

近年來，下一代測序技術(shù)克服了傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)方式的弊端，能夠更加準(zhǔn)確地監(jiān)測、鑒定食品中的微生物[6-10]，因此能夠為預(yù)防食品腐敗變質(zhì)提供新的思路[11-15]。本文對近年來國內(nèi)外的相關(guān)最新研究成果進(jìn)行歸納與總結(jié)，以期為業(yè)內(nèi)科研人員提供具有參考價值和理論依據(jù)的相關(guān)信息。

1 巴氏殺菌乳概述

巴氏殺菌乳具有營養(yǎng)價值高、風(fēng)味品質(zhì)好等特點。因其熱處理方法溫和，營養(yǎng)與風(fēng)味物質(zhì)得到較好地保留，在國內(nèi)外快速地發(fā)展起來并得到廣大消費者的認(rèn)可[16]。

起初，巴氏殺菌的溫度-時間組合選擇基于熱處理量，稍有不慎，就會導(dǎo)致牛乳中未被殺死的致病菌在人體中成為病原體。1986年，國際乳制品聯(lián)合會把巴氏殺菌定義為“一種應(yīng)用于產(chǎn)品的過程，通過熱處理盡可能使產(chǎn)生的有害微生物及危害人體健康的理化性質(zhì)最小化”[17]。1987年，美國食品藥品監(jiān)督管理局公布了專供人食用的乳制品強(qiáng)制巴氏殺菌法[18-20]。

2 巴氏殺菌乳中營養(yǎng)指標(biāo)測定的研究進(jìn)展

2.1 巴氏殺菌乳中營養(yǎng)成分的測定

巴氏殺菌乳中蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、非脂乳固體（solids-not-fat，SNF）等基本營養(yǎng)指標(biāo)的測定，目前應(yīng)用較多的是凱氏定氮法、索氏提取法等常規(guī)檢測方法，但由于這些方法過于耗時、繁瑣，乳品營養(yǎng)成分快速測定分析儀便應(yīng)運而生。乳品分析儀可以迅速檢測牛乳中蛋白質(zhì)、SNF、脂肪、冰點、密度等多個指標(biāo)，是乳品企業(yè)生產(chǎn)中必備的一種快速檢測儀器。

2.1.1 巴氏殺菌乳中蛋白質(zhì)及氨基酸含量的測定

目前，測定食品中蛋白質(zhì)的含量需根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[21]。此標(biāo)準(zhǔn)中有3 種方法，第1種是凱氏定氮法，是檢測蛋白質(zhì)運用極為普遍的方法；第2種是分光光度法，該法具有選擇性高、穩(wěn)定性強(qiáng)等特點，并且1 次可以檢測多個樣品；第3種方法是燃燒法，僅適合蛋白質(zhì)含量10%以上的樣品測定[22-23]。對于乳中蛋白質(zhì)含量的測定，前2 種方法較為多見。近年來，乳品企業(yè)生產(chǎn)逐步采用乳品快速分析儀來迅速檢測牛乳中的蛋白質(zhì)、SNF、脂肪、冰點、密度等多個指標(biāo)。孫雪姣[24]已利用乳品分析儀對不同貯藏條件下巴氏殺菌乳中的營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，結(jié)果精確，耗時少，可以進(jìn)行批量檢測。

隨著相關(guān)研究的深入，對小分子的研究也逐漸升溫，蛋白質(zhì)通過蛋白酶代謝產(chǎn)生的氨基酸含量測定方法也逐步發(fā)展起來。國內(nèi)外氨基酸的測定方法越來越多，主要有高效液相色譜法[25]和比色法[26]，這2 種方法1 次僅能檢測1 種氨基酸，耗時很長，儀器穩(wěn)定性較差，適合小樣本，無法滿足大規(guī)模的實驗研究。近年來，全自動氨基酸分析法的發(fā)明解決了上述一系列問題，如今已被廣泛使用[27-28]。丁瑞雪[29]利用該方法對不同殺菌條件下巴氏殺菌乳的氨基酸含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)該法測定速率快、實用、方便。研究還發(fā)現(xiàn)，乳中的游離氨基酸會影響乳的營養(yǎng)品質(zhì)，而且牛乳的吸收也是人體必需氨基酸的主要攝入方式。目前，GB/T 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》中對乳品樣本中氨基酸的檢測均采用此方法[30-31]。游離氨基酸的測定結(jié)果對人體的影響也有了最新的認(rèn)識[32-33]。研究表明，人初乳中的游離氨基酸含量高于牛乳[34]，原料乳中游離氨基酸的含量、組成也受到牛乳種類、熱處理等方面的影響[33]。

2.1.2 巴氏殺菌乳中脂肪及脂肪酸含量的測定

脂肪含量高低是評價乳品品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)，俗稱“以脂論價”。因此，研究者為了能夠快速、準(zhǔn)確地測定乳中脂肪含量，研究了許多測定方法，包括哥特里羅紫法、分光光度法、離心分離法及蓋勃氏法等。其中，哥特里羅紫法是目前GB/T 5009.46—2003《乳與乳制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》中推薦使用的方法，該方法的穩(wěn)定性較好，因而被廣泛使用，但該方法不適用于酸乳中脂肪的測定[35]。

脂肪酸的種類與適合的比例對維持人體健康具有重要意義。隨著相關(guān)研究工作的開展，該方面的儀器研發(fā)也不斷改進(jìn)，傳統(tǒng)的乙醛抽取法、離心分離法已不再能滿足如今的實驗需求，原子吸收分光光度法、氣相分析法也已成為過去[36-38]。研究表明，采用氣相色譜法對脂肪酸進(jìn)行分析時存在諸多弊端，例如，長碳鏈的酯不易被氣化、以三氟化硼的甲醇溶液進(jìn)行酯化反應(yīng)時易發(fā)生熱降解、同分異構(gòu)化和雙鏈遷移等現(xiàn)象，原因是不飽和脂肪酸酯在受熱時性質(zhì)不夠穩(wěn)定；高效液相色譜法適用于分離熱不穩(wěn)定性化合物，很多報道用其分離分析脂肪酸，該方法迅速簡便，結(jié)果精確可靠[39-42]。研究表明，牛乳中長鏈飽和脂肪酸含量普遍很高，但攝入過多的飽和脂肪酸會對健康產(chǎn)生不利影響[43-45]。近些年來，GC-MS技術(shù)的應(yīng)用為更好地鑒定巴氏殺菌乳的加工工藝條件提供了理論依據(jù)[45-47]。林觀平等[48]曾在湖光牛乳脂肪酸的GC-MS分析過程中發(fā)現(xiàn)，牛乳中飽和脂肪酸含量較高，多不飽和脂肪酸含量則很低。張宇等[49]在對母乳及山羊乳的研究中發(fā)現(xiàn)，母乳中主要功能性脂肪酸含量明顯高于山羊乳，脂肪酸組成極為豐富。研究表明，牛乳、羊乳等原料乳經(jīng)過加工后制成品種多樣的乳制品，能夠提高短鏈飽和脂肪酸含量，更利于人體健康，不僅增加了其經(jīng)濟(jì)價值，更大幅度提高了乳制品的營養(yǎng)利用率[50-51]。

2.2 巴氏殺菌乳感官品質(zhì)及味感的測定

巴氏殺菌乳的感官檢驗從乳品的滋氣味、色澤及組織狀態(tài)3 個方面進(jìn)行評價。依據(jù)RHB101—2004《巴氏殺菌乳感官質(zhì)量評鑒細(xì)則》，通過感官分析培訓(xùn)的人員對巴氏殺菌乳的組織狀態(tài)、滋氣味和色澤進(jìn)行感官評鑒。進(jìn)而對所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，獲得巴氏殺菌乳的感官評鑒分?jǐn)?shù)。然而，人為感官鑒評中客觀因素很多，近些年此方法逐漸被新方法所替代[24]。

電子舌是一種液體味道的新型檢測方法[52]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于乳制品檢測中。叢艷君等[53]使用電子舌對6 種固化酸乳進(jìn)行分類。吳進(jìn)菊等[54]也利用電子舌對市場上采用發(fā)酵劑制作的酸乳進(jìn)行滋味品質(zhì)的測定，結(jié)果表明，樣品間酸度差異最大，其次是咸味，其余指標(biāo)差異相對較小。隨著巴氏殺菌條件的改變，酸味味感值變化極為明顯，這表明滅菌過程也是控制牛乳質(zhì)量的重要因素。

目前，電子舌重點應(yīng)用于不同品牌牛乳的質(zhì)量檢測，對樣品的味道特征進(jìn)行綜合評價[55-58]。Toko等[59]首先將電子舌技術(shù)應(yīng)用于牛乳分析，利用偏最小二乘回歸模型、主成分分析等分析方法驗證了電子舌可以較好地區(qū)別不同貯藏時間、不同熱處理工藝及不同貯藏溫度下的牛乳。Dias等[60]將電子舌技術(shù)用于鑒別羊乳中摻雜的牛乳。Sim等[61]評估巴氏殺菌乳和超高溫加熱處理（ultra-hightemperature，UHT）乳2 種商品乳的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)電子舌能夠較好地反映不同貯藏時間內(nèi)牛乳的質(zhì)量變化。

2.3 巴氏殺菌乳風(fēng)味及氣味的測定

對于牛乳風(fēng)味品質(zhì)的研究很早就已經(jīng)開始，但限于當(dāng)時的技術(shù)和儀器發(fā)展水平，風(fēng)味的初步評價還是由專業(yè)評估人員進(jìn)行。隨著深加工生產(chǎn)的出現(xiàn)，新型儀器的重要性逐漸顯現(xiàn)。

電子鼻是能夠處理樣品中揮發(fā)性成分相關(guān)信息的一種新技術(shù)[62]。電子鼻在牛乳中的重點應(yīng)用包括品質(zhì)識別[63]、摻假分析[64-65]、風(fēng)味特征分析[66-69]及污染情況評定[70-73]等方面。采用聚類分析法和電子鼻傳感器分析法對保質(zhì)期內(nèi)巴氏殺菌乳的感官品質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行分析和評定，研究表明，電子鼻對樣品整體風(fēng)味的區(qū)分和識別效果良好，樣品與第2主成分的負(fù)相關(guān)性增強(qiáng)，保質(zhì)期內(nèi)的巴氏殺菌乳風(fēng)味顯示出較為明顯的差異[74]。宋慧敏等[75]利用電子舌和電子鼻對不同熱處理牛乳的風(fēng)味品質(zhì)進(jìn)行測定，通過判別因子法和主成分分析法對測定結(jié)果進(jìn)行處理和分析，結(jié)果表明，熱處理方式對牛乳的風(fēng)味品質(zhì)影響較大，并且，牛乳的風(fēng)味品質(zhì)與熱處理程度具有一定的相關(guān)性。將2 種技術(shù)結(jié)合起來能很好地區(qū)分牛乳的熱處理程度，并且能對牛乳的加熱程度進(jìn)行大致判斷。

乳制品的風(fēng)味是影響貨架期、消費者接受度和其他屬性的重要參數(shù)[76]。液態(tài)原料乳極易受到影響，因其中存在耐熱酶及多種微生物[77]，當(dāng)利用熱處理工藝來破壞微生物負(fù)荷及酶活性時，牛乳風(fēng)味將會不同于原料乳[69]。在經(jīng)典的風(fēng)味分析中，根據(jù)不同的提取方法（頂空萃取分離、固相微萃取、動態(tài)頂空萃取和攪拌棒吸附萃取）分析和測定牛乳中的香味物質(zhì)[78-81]是揮發(fā)性物質(zhì)測定的主要步驟。揮發(fā)性化合物是食品風(fēng)味香氣的重要來源，但僅有一小部分存在于食品中的揮發(fā)性化合物擁有風(fēng)味活性，并對風(fēng)味有所貢獻(xiàn)[82]。Olmedilla等[83]研究發(fā)現(xiàn)，利用氣相色譜法在熱處理牛乳中共發(fā)現(xiàn)5 類重要的揮發(fā)性物質(zhì)，分別為酮類、硫化物、醛類、苯環(huán)類和蒽醌類。Licón等[84]研究發(fā)現(xiàn)，酮類是許多牛乳中的標(biāo)志性揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。近期的研究表明，GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)，醛類物質(zhì)是牛乳風(fēng)味和乳脂氧化反應(yīng)的共同特征產(chǎn)物[85-86]。丁瑞雪[29]也利用GC-MS方法對不同殺菌條件下巴氏殺菌乳的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定，此方法操作簡便，共檢測出21 種風(fēng)味物質(zhì)，能夠較好地判斷不同殺菌條件下巴氏殺菌乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化情況。

3 巴氏殺菌乳中微生物群落的研究進(jìn)展

3.1 微生物純培養(yǎng)技術(shù)

微生物在牛乳的腐敗變質(zhì)過程中起到至關(guān)重要的作用，人們從巴斯德時期就認(rèn)識到了這一點。數(shù)百年來，學(xué)者們研究出許多檢驗牛乳中微生物的方法，如標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法、美蘭還原酶實驗法、顯微鏡鏡檢計數(shù)法等，均以傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，自然界中的絕大部分微生物屬于未培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物，不能采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式進(jìn)行分離、培養(yǎng)[87]。此外，現(xiàn)有條件無法滿足許多微生物生長所需。菌落總數(shù)一直以來是被用于評價牛乳中微生物的主要指標(biāo)，但是菌落總數(shù)也僅是數(shù)量上的統(tǒng)計，無法鑒別牛乳中微生物的種類。因此該方法存在很多不足，牛乳的菌落總數(shù)并不能完全反映牛乳中的微生物狀況。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)

利用不同濃度的尿素和甲酰胺配制聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行實驗，可以使不同序列的DNA被分開[88]。和其他方法相比，PCR-DGGE的優(yōu)越之處是不需進(jìn)行微生物純培養(yǎng)，既能縮短實驗時間，又能把樣品中未培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物的遺傳物質(zhì)鑒定出來。例如，趙亮等[89]采用PCR-DGGE技術(shù)研究白酒中的微生物群落組成；王穩(wěn)航等[90]采用PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)酵肉制品的菌群組成。

3.3 PCR-溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）技術(shù)

PCR-TGGE與PCR-DGGE的基本原理相似，但是2 種方法的變量不同，PCR-TGGE不會改變凝膠中尿素、甲酰胺的濃度，而是改變溫度。電泳在凝膠金屬板上進(jìn)行，金屬板上的溫度梯度凝膠可以對來自同一PCR產(chǎn)物的不同DNA片段進(jìn)行高效分離。與PCR-DGGE技術(shù)相比，PCR-TGGE技術(shù)因其凝膠膠體小、操作簡便，更節(jié)省時間，實驗結(jié)果的重現(xiàn)性更高。顧采東[91]在分析不同熱處理方法對牛乳殺菌效果的影響時利用了PCR-TGGE技術(shù)。

3.4 高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)

HTS技術(shù)亦稱為“下一代”測序技術(shù)[11,92]，可以同時高效測序從多個樣品中提取的DNA。一系列分子水平測序方法，如基因組測序已被廣泛應(yīng)用[93-94]。

最近已有相關(guān)研究人員采用HTS技術(shù)描述乳制品中的微生物群體，并且已經(jīng)證明HTS技術(shù)的采用大大增加了測序通量，豐富了實驗分析中的信息量，同時提供微生物多樣性的綜合分析[95]。Aldrete-Tapia等[96]通過HTS技術(shù)研究手工干酪的細(xì)菌菌群多樣性和群落結(jié)構(gòu)。HTS技術(shù)的應(yīng)用在理解乳制品中細(xì)菌群落的多樣性方面取得了快速進(jìn)展。

為測定原料乳中微生物區(qū)系的分布，于國萍等[97]利用HTS技術(shù)對14 個奶牛場的原料乳進(jìn)行了序列測定，以測定微生物區(qū)系的多樣性和病原菌的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同牧場原料乳的菌群存在多樣性，并且個體養(yǎng)牛場的原料乳中也存在金黃色葡萄球菌和志賀氏菌，還時常檢測到一些不太豐富的雙歧桿菌科和莫拉氏菌科?，斠罉贰ぐＬ岬萚98]利用HTS技術(shù)對南疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳中的微生物群落多樣性進(jìn)行鑒定和分析，結(jié)果表明，各組樣品間的微生物在數(shù)量和種類上存在明顯差異。李盈盈[99]在研究某品牌乳粉加工過程中不同階段的微生物多樣性時采用了HTS技術(shù)，結(jié)果表明，原料乳階段的物種豐度、操作分類單元數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)多樣性均低于其他3 個加工階段（濕混乳、濃縮乳、乳粉），進(jìn)而可以得出結(jié)論，在乳粉加工過程中應(yīng)密切關(guān)注其微生物多樣性的變化，這對于避免乳粉的微生物污染具有重要意義。

4 結(jié) 語

隨著現(xiàn)代風(fēng)味檢測技術(shù)在乳品行業(yè)的推廣，與UHT乳相比，巴氏殺菌乳在感官品質(zhì)上的優(yōu)勢逐漸凸顯。HTS技術(shù)的應(yīng)用使得以前從未在巴氏殺菌乳中被檢測出的微生物被發(fā)現(xiàn)，這對于提高巴氏殺菌乳感官品質(zhì)、優(yōu)化巴氏殺菌乳生產(chǎn)工藝和延長巴氏殺菌乳貨架期具有重要的指導(dǎo)意義。同時，巴氏殺菌乳風(fēng)味品質(zhì)與其中殘留微生物的相互關(guān)系值得進(jìn)一步研究。