橡膠樹內(nèi)生生物資源研究進(jìn)展①

徐 龍 譚德冠 張家明

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇南京210059;2中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?71101)

橡膠樹（Hevea brasi l iensis）是熱帶地區(qū)高大喬木，又名巴西橡膠樹或三葉橡膠樹，屬于大戟科橡膠屬，原產(chǎn)于南美洲亞馬遜河流域的熱帶雨林。橡膠樹所產(chǎn)的天然橡膠為四大工業(yè)原料之一，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、交通、國防、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥業(yè)和日常生活中［1]。我國于1904年開始引種橡膠樹，目前植膠面積已達(dá)100萬hm2，主要分布在海南、云南、廣東等地，已成為我國熱區(qū)重要的支柱產(chǎn)業(yè)［2]。

植物內(nèi)生生物是指其全部或部分的生命階段生活在健康植物的莖干、葉片和根等器官組織中，但不會(huì)引起宿主明顯病害癥狀的一類微生物或藻類，包括潛伏在植物體內(nèi)的病原菌、菌根菌和綠藻［3-4]。植物內(nèi)生生物包括內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）、內(nèi)生細(xì)菌 （Endophytic bacteria）、放線菌（Actinomycetes）和內(nèi)生藻（Endophytic algae），它們廣泛存在于高等和低等植物中。一些植物內(nèi)生生物所分泌的次生代謝物具有促進(jìn)植物生長、抗非生物逆境、抗植物病蟲害、抗人類病原菌等功能，在農(nóng)業(yè)、植物保護(hù)、醫(yī)藥業(yè)等領(lǐng)域具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

橡膠樹長期生長在溫度高、濕度大、降雨充沛的環(huán)境中，該環(huán)境中富含微生物，同時(shí)其樹皮被定期開割以便采收膠乳，因此橡膠樹樹皮更容易被環(huán)境中微生物入侵。橡膠樹主要通過芽接營養(yǎng)繁殖進(jìn)行培育，可以使體內(nèi)的生物在子代間進(jìn)行傳播。這些因素使得橡膠樹內(nèi)生生物資源極為豐富。本文系統(tǒng)綜述了橡膠樹內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生藻的研究進(jìn)展，對促進(jìn)橡膠樹內(nèi)生生物資源的開發(fā)利用具有一定的意義。

1 橡膠樹內(nèi)生真菌

1.1 橡膠樹內(nèi)生真菌的多樣性

橡膠樹內(nèi)生真菌多樣性十分豐富，各國科研人員所分離到內(nèi)生真菌種類及優(yōu)勢菌種存在較大差異，但橡膠樹的內(nèi)生真菌組成具有一定的地域?qū)Ｒ恍浴?/p>

南美洲亞馬遜流域是橡膠樹源產(chǎn)地，該地區(qū)的橡膠樹內(nèi)生真菌多樣性十分豐富，主要為子囊菌亞門，其優(yōu)勢菌株為刺盤孢屬和木霉屬。Vaz等［5]從巴西亞馬遜流域的東面2個(gè)原始區(qū)域各隨機(jī)挑選4株成齡橡膠樹，從這些樹上采集成熟健康葉片分離內(nèi)生真菌，從240個(gè)葉片樣品中共分離到210株內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)2地點(diǎn)所采集的樣品其內(nèi)生真菌的種類差別較大，子囊菌亞門占95.71%，擔(dān)子菌亞門占4.28%，共涉及14個(gè)科21個(gè)屬，優(yōu)勢菌種為刺盤孢屬和木霉屬（Trichodermasp）。Gazis等［6]從秘魯東南部的亞馬遜流域橡膠樹葉片和邊材中分離出175株內(nèi)生真菌，其中97%的菌株為子囊菌（Ascomycota），其余的為擔(dān)子菌類（Basidiomycota）和結(jié)合菌類（Zygomycota），其中青霉菌（Penici l l ium）、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）和木霉屬為優(yōu)勢菌。他們從所分離的橡膠樹內(nèi)生真菌中鑒定出一株新的木霉菌Trichoderma amazonicum［7]。他們進(jìn)一步對位于秘魯?shù)膩嗰R遜流域的橡膠樹內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行大規(guī)模研究，從8個(gè)地點(diǎn)分別選取95株自然狀態(tài)下生長的橡膠樹（野生樹）和95株人工栽培管理?xiàng)l件下的橡膠樹（栽培樹）作為研究對象，取它們的葉片和邊材分離內(nèi)生真菌，共分離到2 346株菌，根據(jù)ITS序列相似性歸類，共有710個(gè)種，野生樹和栽培樹分別有411和404個(gè)種，有105個(gè)種是雙方共有的，雙方的優(yōu)勢種均為刺盤孢屬和木霉屬［8]。

中國橡膠樹來源于亞馬遜流域，中國海南地區(qū)所分離到的橡膠樹內(nèi)生真菌主要為半知菌和子囊菌，與原產(chǎn)地存在一定差異。如鄭鵬等［9]從海南省海口地區(qū)的橡膠樹品種熱研7-33-97的枝條中分離到18株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定均屬于半知菌類（Fungi Imperfecti），其優(yōu)勢菌群為無孢菌群（Mycel ia Steri l ia）。李曉娜等［10]采集海南省儋州地區(qū)橡膠樹RRIM600品系的葉、枝、果、根等組織進(jìn)行分離培養(yǎng)，共獲得內(nèi)生真菌545株，根據(jù)形態(tài)特征對482株產(chǎn)生孢子的菌株進(jìn)行鑒定，分為半知菌和子囊菌，其中擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）、黑孢屬（Nigrospora）和刺盤孢屬（Col letotrichum）為優(yōu)勢種。其后又在海南島15個(gè)不同地區(qū)的橡膠樹分離出507株內(nèi)生真菌，通過形態(tài)學(xué)鑒定分為18個(gè)屬，其中穗黑孢霉（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢（Nodul isporium sylviform）、刺盤孢（Col letotrichum）、梨葉點(diǎn)霉（Phyl losticta pirina）和擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis rich）等真菌為優(yōu)勢種。

1.2 橡膠樹不同組織器官內(nèi)生真菌的差異性

熱帶雙子葉植物的內(nèi)生真菌主要依靠水平傳播，內(nèi)生真菌主要以孢子的形式通過空氣、雨水或昆蟲等媒介在宿主間傳播。內(nèi)生真菌的成功定殖受空氣流動(dòng)和內(nèi)生真菌自身豐度等因素的影響［11-12]。內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)定殖的方式與病原菌入侵相同，可以通過直接穿透、傷口或自然開口（氣孔或皮孔）進(jìn)入植物體內(nèi)。內(nèi)生真菌除了由外界傳入植物體內(nèi)定殖外，還可以通過營養(yǎng)繁殖方式從親本中獲得。

橡膠樹不同的組織器官中均存在內(nèi)生真菌，不同組織器官中內(nèi)生真菌的數(shù)量和種類具有較大的差異。李曉娜等［10]在從橡膠樹RRIM600品種不同組織內(nèi)分離出的內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量依次為葉片＞枝條＞根＞花枝＞果，其中擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）和黑孢屬（Nigrospora）真菌為橡膠樹穩(wěn)定內(nèi)生真菌，在這5種組織中均有分布。但是在海南不同地區(qū)橡膠樹分離得到的真菌分布情況為枝條＞葉片＞根＞果實(shí)，其中穗黑孢霉菌（Nigrospora oryzae）、樹狀多節(jié)孢菌（Nodul isporium sylviform）和刺盤孢菌（Col letotrichumsp.）在不同地區(qū)橡膠樹中均有分布［13]。然而，Gazis等［6]發(fā)現(xiàn)橡膠樹邊材的內(nèi)生真菌種類比葉片的多，其中木霉屬和青霉屬為邊材中最常見菌屬，而擬盤多毛孢屬和木霉屬在葉片中分布較多。這些研究表明不同地區(qū)的橡膠樹其不同組織器官內(nèi)生真菌的差異性可能由其定殖環(huán)境、樹齡或器官的生長狀態(tài)的差異所造成。

Marine等［14]與Rocha等［15]均在巴西巴伊亞的橡膠林采集葉片材料來進(jìn)行橡膠樹內(nèi)生真菌的分離研究，但他們所分離出的真菌種類有較大差異，導(dǎo)致這種差異的原因可能是由于采樣時(shí)葉片的成熟度存在差異所造成。

此外，橡膠樹有著和其他喬木不同的組織——乳管組織，橡膠樹可以通過乳管分泌膠乳，在乳膠中也同樣有著內(nèi)生真菌的分布［9]。菌木霉屬較多，這與野生橡膠樹更難得病有很大的關(guān)系。以往的研究表明，木霉菌可以寄生真菌病原體，或者產(chǎn)生抗真菌次生代謝產(chǎn)物，與真菌病原體競爭生存位，以此促進(jìn)宿主生長增強(qiáng)植物的抗病性［18-19]。

1.3.2 耐鹽功能

鄭鵬等［20]發(fā)現(xiàn)，橡膠樹內(nèi)生真菌菌株ITBB2-1具有很強(qiáng)的抗鹽性，在培養(yǎng)基中添加2倍海水鹽度的NaCl能顯著促進(jìn)菌落生長，經(jīng)鑒定該菌株為麥軸梗屬（TritirachiumLimber）真菌；隨后采用花粉管通道法將ITBB2-1的基因組DNA導(dǎo)入擬南芥中，經(jīng)篩選，獲得3株耐鹽性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株［21]。這些耐鹽性強(qiáng)的內(nèi)生真菌可極大豐富耐鹽基因的挖掘和利用。

1.3 橡膠樹內(nèi)生真菌的功能

1.3.1 植物病原菌的拮抗作用

橡膠樹內(nèi)生真菌對于一些植物病原菌具有顯著的拮抗作用。鄭鵬等［9]從橡膠樹中分離出的青霉屬（Penici l l ium）內(nèi)生真菌ITBB2-2、ITBB2-15菌株對香蕉枯萎病菌和橡膠炭疽病菌都有較強(qiáng)的拮抗作用。Rocha等［15]從橡膠樹中篩選出可以抑制南美葉枯疫病（SALB）致病菌微環(huán)菌（Microcyclus ulei）的內(nèi)生真菌，使用濃度為12.5%的Fusariumsp.、Gibberel lasp.、Glomerel la cingulata、Microsphaeropsissp.和Myrotheciumsp.等內(nèi)生真菌的凍干發(fā)酵液對其抑制率高達(dá)80%，首次證明橡膠樹內(nèi)生真菌對分生孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用。Siriudom等［16]在橡膠樹葉片中分離出3株產(chǎn)氣霉菌Muscodor，其產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）具有對細(xì)菌、酵母和絲狀真菌生物拮抗的潛力。此外，Muscodor的VOCs對引起橡膠樹根系病害的病原菌Phel linus noxius和Rigidoporusmicroporus具有較強(qiáng)的拮抗作用，其生物活性揮發(fā)性代謝物主要組分是3-甲基丁醇、3-甲基丁基乙酸酯和甘菊衍生物［16-17]。這些研究結(jié)果說明這些內(nèi)生真菌在橡膠生產(chǎn)中可以作為一種有效的生物防治劑。

Gazis等［8]發(fā)現(xiàn)，木霉屬的豐度與潛在的致病微生物之間存在顯著的負(fù)相關(guān)，表明木霉屬真菌具有抑制炭疽病菌的效果，主要是通過菌株生長間的競爭來產(chǎn)生拮抗效果；數(shù)據(jù)表明人工橡膠林中拮抗真菌木霉屬較少，而野生橡膠樹中拮抗真

2 橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌

橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌被分離到的數(shù)量和種類雖然遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于其內(nèi)生真菌，但大部分橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌是有益的，其次生代謝物具有生物防治或促進(jìn)植物生長方面的功能。

2.1 橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌的多樣性

不同的研究團(tuán)隊(duì)所分離到的橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌種類和數(shù)量存在一些差異，所分離到的芽孢桿菌種類較多。趙璐璐等［22]從橡膠樹根部分離得到的內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌（Baci l lus subti lis）Czk1菌株。時(shí)濤等［23]從成年開割橡膠樹品種RRIM 600的不同組織中共分離到47株內(nèi)生細(xì)菌，對具拮抗功能的菌株REBHN10和REBHN36進(jìn)行鑒定，分別屬于枯草芽孢桿菌和莫哈韋芽孢桿菌。Minh等［24]從橡膠樹的葉片和邊材中分離到21株內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)具拮抗功能的菌株T9和T16均為蘇云金芽孢桿菌（Baci l lus thuringiensis）。

除了芽孢桿菌外，橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌還存在其他類型菌株。Abraham等［25]從橡膠樹品種RRII 105和RRIM600的根、葉片、樹柄中分離到252株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)篩選得到6株對疫霉屬落葉病（Phytophthorameadii）具拮抗效果，其中1株為產(chǎn)堿菌屬（Alcal igenessp），另5株為銅綠假單胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）。Hidayati等［26]從橡膠樹品種IRR 118和IRR39的葉片、樹皮和根中分離出117種內(nèi)生細(xì)菌，對其中5株菌株進(jìn)行鑒定，分別屬于蠟樣芽胞桿菌（Baci l lus cere-us） 、銅綠假單胞菌、短柄菌（Brachybacterium paraconglomeratum）和天命菌（Providencia vermicola）。Tan等［27]從橡膠樹枝條中分離到1株內(nèi)生細(xì)菌ITBBB5-1，經(jīng)鑒定確定該菌株為粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratiamarcescens）。Linda等［28]從橡膠樹葉片中分離到9株內(nèi)生細(xì)菌，其中產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的菌株D35為克雷伯氏菌（Klebsiel la variicola）。

2.2 橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌的功能

2.2.1 拮抗功能

橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌對橡膠樹的一些重要病原菌具有顯著的拮抗效果，在生物防治方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院鄭服叢研究團(tuán)隊(duì)從橡膠樹根部分離得到的內(nèi)生細(xì)菌枯草芽孢桿菌（Baci l lus subti l is）Czk1菌株，發(fā)現(xiàn)其對5種橡膠樹根病和1個(gè)橡膠樹炭疽病具有強(qiáng)烈的拮抗作用，且該內(nèi)生細(xì)菌持續(xù)接種20代后依然表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑菌性，表明該菌株具有抗菌譜廣、持久穩(wěn)定等特點(diǎn)，具有較高的潛在生防利用價(jià)值，并對該菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化［22，29-30]。時(shí)濤等［23]發(fā)現(xiàn)，橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌REBHN10和REBHN36對橡膠樹棒孢霉落葉病菌和炭疽病菌具有較好的拮抗作用。Minh等［24]也發(fā)現(xiàn)，橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌T9和T16能顯著抑制橡膠樹棒孢霉落葉病菌的萌發(fā)。Abraham等［25]分離到的6株橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌對引起橡膠樹落葉的疫霉菌（Phytophthora meadii）具有顯著的防治效果。橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌ITBBB5-1發(fā)酵液能抑制橡膠樹白粉病孢子的萌發(fā)，具有防治橡膠樹白粉病的功能［31]。

此外，橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌對其他作物的一些病原菌具有防治效果。盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)證明橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌ITBB B5-1具有防治香蕉枯萎?。‵OC4） 的顯著效果［27]。

研究人員深入探討了橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌防治作物病原菌的機(jī)制。Abraham等［32]從橡膠樹葉片、葉柄和根中分離到48株內(nèi)生細(xì)菌，檢測它們發(fā)酵液的葡聚糖酶活性，發(fā)現(xiàn)菌株REB20葡聚糖酶活性最高，該菌株對橡膠樹疫霉屬落葉病拮抗效果顯著，并克隆該菌株的葡聚糖酶基因。Tan等［27]發(fā)現(xiàn)橡膠樹內(nèi)生菌ITBBB5-1的發(fā)酵液含有葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，用該發(fā)酵液處理FOC4菌絲后，F(xiàn)OC4菌絲胞壁降解嚴(yán)重。Linda等［28]發(fā)現(xiàn)，橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌D5和D35產(chǎn)幾丁質(zhì)酶，其幾丁質(zhì)酶指數(shù)分別達(dá)1.66和2.08。葡聚糖和幾丁質(zhì)是作物病原菌細(xì)胞壁的主要成分［33]。這些研究結(jié)果表明，橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌防治作物病原菌的機(jī)制主要是通過分泌幾丁質(zhì)酶或葡聚糖酶，來分解病原菌的細(xì)胞壁，從而達(dá)到生物防治的目的。

2.2.2 促進(jìn)植物生長功能

一些內(nèi)生細(xì)菌具有促進(jìn)植物生長的功能，它們主要通過加強(qiáng)植物的固氮能力、增加磷酸鹽的溶解性和鐵元素的利用效率，以及產(chǎn)生一些植物激素，如生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素等來實(shí)現(xiàn)該功能。Hidayati等［26]對117株橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌采用過激反應(yīng)、溶血試驗(yàn)和發(fā)芽生長試驗(yàn)，篩選到試驗(yàn)效果最好的5株菌株。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它們具有較強(qiáng)的固氮能力，同時(shí)能產(chǎn)生一定濃度的吲哚乙酸、赤霉素、玉米素和激動(dòng)素。賀春萍等［34]發(fā)現(xiàn)，橡膠樹內(nèi)生細(xì)菌Ckz1對橡膠樹幼苗的生長具有明顯的促進(jìn)效果，能夠顯著提高幼苗葉綠素含量，表明該菌株能夠增強(qiáng)植株的光合作用，對橡膠樹具有顯著的促生作用。

3 橡膠樹內(nèi)生藻

藻類是自然界中一類低等的、自養(yǎng)放氧型植物。目前已知的約有3萬種左右，包括藍(lán)細(xì)菌、綠藻、紅藻和褐藻等眾多真核和原核生物，以及某些異養(yǎng)型和共生型生物。藻類分布的范圍極廣，適應(yīng)性較強(qiáng)，不僅能夠在江河湖海中生長，也能在潮濕的地方生長［35]。藻類的適應(yīng)能力很強(qiáng)，能夠獨(dú)自生長，也能附著在動(dòng)、植物體表生活，還有的藻類成為一種內(nèi)生植物。

藻類內(nèi)生于高等植物的報(bào)道很少。Zhang等［36]通過對橡膠樹莖進(jìn)行消毒滅菌，首次從樹皮和木質(zhì)部之間分離出一種生長在橡膠樹內(nèi)部的綠藻，對其進(jìn)行形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)其為原球藻綱的新屬種，為橡藻屬（Heveochlorel la），并將該藻命名為海南橡藻（Heveochlorel la hainangensis）。海南橡藻成熟細(xì)胞內(nèi)有一個(gè)杯狀的亮綠色葉綠體，少數(shù)細(xì)胞可見2～4個(gè)紡錘狀葉綠體。葉綠體的分裂方式很獨(dú)特，分裂開始于縱向的一側(cè)，并持續(xù)到另一側(cè)，直到葉綠體完全分離。這種分裂方式在其它植物中未見報(bào)道，與典型的二元分裂模式明顯不同［37]。

在海南橡藻發(fā)現(xiàn)之前，在銀杏樹體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種膠球藻（Coccomyxa）［38]。這種綠藻以前體的形式存在于銀杏細(xì)胞內(nèi)，不具有葉綠體和細(xì)胞核，不能進(jìn)行光合作用，但該內(nèi)生綠藻從銀杏的細(xì)胞內(nèi)釋放出來之后便很快形成葉綠體和細(xì)胞核，并且恢復(fù)光合作用。然而海南橡藻在自養(yǎng)條件下光合作用微弱，幾乎停止生長，需要補(bǔ)充碳源才能離體培養(yǎng)，主要是由于海南橡藻生長于橡膠樹體內(nèi)，長期在內(nèi)生無光源環(huán)境下生活，導(dǎo)致其調(diào)控光合作用相關(guān)基因發(fā)生變化，使得其喪失光合作用能力，不能恢復(fù)其光合能力。

通過對海南橡藻脂肪酸成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其脂肪酸成分較為單一，具有較高比例的茉莉酸生物合成的前體——亞麻酸［39]。據(jù)報(bào)道，茉莉酸具有促進(jìn)橡膠樹乳管分化的作用［40]，而乳管的生物學(xué)功能主要是抵御病蟲害［41]，因此海南橡藻在適應(yīng)橡膠樹內(nèi)生環(huán)境的進(jìn)化過程中油脂積累能力的増強(qiáng)可能是與橡膠樹協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果。此外，海南橡藻在含纖維素的培養(yǎng)基上在黑暗條件下培養(yǎng)，被誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶，能降解培養(yǎng)基中的纖維素，獲得碳源，進(jìn)行生長繁殖，同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)積累油脂，油脂含量達(dá)42%［42]。該藻種為秸稈等纖維素轉(zhuǎn)化為生物能源提供了新途徑，具有潛在的商業(yè)價(jià)值。

4 展望

橡膠樹內(nèi)生生物資源研究雖然起步晚，但已報(bào)道分離出的內(nèi)生生物上千種，部分內(nèi)生生物已被鑒定，其功能也被挖掘，一些橡膠樹內(nèi)生生物在植物病原菌生物防治、耐鹽功能基因的挖掘、促進(jìn)植物生長、生物質(zhì)能源利用等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。但橡膠樹內(nèi)生生物資源的功能遠(yuǎn)非這些，還需進(jìn)一步加強(qiáng)挖掘力度。同時(shí)，雖有較多研究已報(bào)道橡膠樹內(nèi)生菌對橡膠樹和其它作物重要病原菌具顯著拮抗效果，但這些菌株次生代謝物的具體活性物質(zhì)卻尚未清楚，需要進(jìn)一步深入該方面研究。