布魯菌噬菌體的生物學(xué)特性研究進展

康耀霞，解英波，羅文博

1. 包頭市疾病預(yù)防控制中心， 包頭 014030； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)綜合疾病預(yù)防控制中心， 呼和浩特 010031

布魯菌屬(Brucellae)細(xì)菌所致的布魯菌病是一種嚴(yán)重威脅人體健康和生產(chǎn)活動的人畜共患病。布魯菌共有12個種[1]，分別是羊種(B.melitensis)、豬種(B.suis)、牛種(B.abortus)、綿羊種 (B.ovis)、犬種(B.canis)和沙林鼠種(B.neotomae)；由海洋動物分離的鰭種(B.ceti)和鯨種 (B.pinnipedialis)[2]；土壤中分離的田鼠種(B.microti)[3]；乳房移植物中分離的湖浪布魯菌 (B.inopinata)[4]；紅狐中分離的B.vulpis[5]和竹子中分離的B.papionis[6]。近年來，在兩棲動物蛙中發(fā)現(xiàn)新的布魯菌[5]。各種間在核酸水平上有90%以上的相似性[7]。目前，布魯菌的鑒定、分型分別在核酸水平和生化水平進行，即對布魯菌可疑菌落的多價抗血清凝集試驗，二氧化碳需求試驗，硫化氫產(chǎn)生試驗，單因子血清A、R和M的凝集試驗，以及噬菌體的特異性裂解反應(yīng)[7-8]；bcsp31基因和IS711插入序列的PCR鑒定[9-10]，多重PCR(如AMOS等用于種的分析)[11-12]。目前還沒有一種分子分型系統(tǒng)可以覆蓋布魯菌的全部種和型，噬菌體裂解實驗在布魯菌鑒定中依然具有不可替代的作用。布魯菌噬菌體的參考品在改變其增殖菌后，獲得噬菌體突變體[13]，即使相同的噬菌體，也會得出不完全一致的分型結(jié)果[14]。因此，噬菌體的生物學(xué)特性直接影響其宿主特異性和裂解活性。本文就布魯菌噬菌體的生物學(xué)特性進行綜述。

1 布魯菌噬菌體的組成、形態(tài)特征及分型作用

20世紀(jì) 50―60 年代發(fā)現(xiàn)了噬菌體對布魯菌的感染和裂解作用[15-16]。1950年Tbilisi (Tb)噬菌體由B.abortus141菌株培養(yǎng)分離到，由疫苗株S19 (B.abortus)傳代培養(yǎng)，是最早用于分型的布魯菌噬菌體，到20世紀(jì)80年代形成了由Tb、Firenze (Fi)、Weybridge (Wb)、Berkeley 2 (Bk2)、R/C和Izatnagar (Iz)組成的噬菌體參考品[8, 17]，被世界各地實驗室沿用至今。后來分離到的噬菌體突變體，如S708、F1、F25、Np、NMg-1和NMg-2等，作為分型系統(tǒng)的補充，也被用于布魯菌的鑒定[13, 18-21]，大部分噬菌體由表面抗原為光滑型脂多糖的B.abortus、B.suis和B.melitensis分離到[14, 20, 22-24]，裂解粗糙型布魯菌的噬菌體來源于實驗室裂解光滑型布魯菌噬菌體[14, 17]。

布魯菌噬菌體是線性非包膜雙鏈DNA病毒，均具有短尾噬菌體科的形態(tài)，電子顯微鏡下觀察到一個直徑50～80 nm的二十面體頭和一個寬 10～15 nm、長7～9 nm的非收縮性尾[25]。布魯菌噬菌體之間具有很近的親緣關(guān)系[19]，屬于同一物種[22, 26]，因此，有些布魯菌噬菌體具有幾乎相同的宿主特異性[23]。

噬菌體不同株在布魯菌6個種和非典型布魯菌的鑒定中起著重要作用。噬菌體的參考品在常規(guī)檢測濃度(routine test dilution，RTD)下裂解布魯菌產(chǎn)生噬斑，通常采用RTD和104×RTD的噬菌體懸液對粗糙型和光滑型布魯菌進行鑒定、分型[8, 27]，其缺點是不能區(qū)分噬菌體增殖菌和被自外裂解(lysis from without)殺死的細(xì)菌，后者因細(xì)菌吸附大量噬菌體顆粒而導(dǎo)致細(xì)胞壁破壞[17]。6種噬菌體的參考品均不能裂解B.inopinata；除R/C不裂解B.ceti外，其余5種噬菌體可抑制B.ceti的生長，但噬菌體本身不發(fā)生增殖[28]。此外，噬菌體的突變體也具有一定的鑒定、分型作用，如崔等[21]采用誘變和純化方法，將分離到的布魯菌噬菌體SA(對犬種菌有低裂解活性)培育成對犬種布魯菌具有較高裂解活性的噬菌體NMg-1和NMg-2，對變異B.melitensis的鑒定具有滿意的效果。Morris 等發(fā)現(xiàn)A422和M51噬菌體在B.suis上均可產(chǎn)生噬斑[14]，所以噬菌體參考品以外新發(fā)現(xiàn)的噬菌體可作為分型系統(tǒng)的補充，使某些布魯菌的區(qū)分更可靠。

2 布魯菌噬菌體的生長特性

噬菌體對布魯菌的分型反應(yīng)由吸附率和感染率決定。Tb在B.abortus中培養(yǎng)具有很高的吸附率和感染率，并產(chǎn)生大而清晰的噬斑；Tb在B.neotomae中僅有一半細(xì)菌被1個或多個噬菌體顆粒裂解，部分細(xì)菌經(jīng)過感染周期釋放的噬菌體顆粒只產(chǎn)生小而清晰的噬斑；B.suis則需要更多的Tb顆粒來裂解，不發(fā)生復(fù)制也沒有噬斑產(chǎn)生；在B.melitensis中，抑制菌苔的生長則需要更多的Tb顆粒。B.abortus除了被Tb吸附形成空斑外，還會出現(xiàn)一種只吸附但不發(fā)生裂解的中間狀態(tài)，通過延長潛伏期，有一部分細(xì)菌被感染并釋放成熟的噬菌體顆粒，在噬菌體出現(xiàn)自然突變前，被感染的培養(yǎng)物或菌落形態(tài)看起來是正常的，當(dāng)Tb發(fā)生突變后宿主菌變得白而黏，而且突變體比親代噬菌體能更有效地穿透細(xì)胞壁，更快地繁殖[29]。

噬菌體在不同的增殖菌中吸附時間、吸附率、裂解時間及顆粒釋放數(shù)有所不同。Tb以B.abortusS19和B.abortus141為飼養(yǎng)菌，吸附時間分別為180和190 min，平均釋放顆粒數(shù)分別為50～53 PFU/cell和40～46 PFU/cell。另外，不同的噬菌體在B.abortus141中生長情況也不同，噬菌體544的吸附時間在90～100 min，其他噬菌體如110、141、11sa、1066、281、177、V等則在120～190 min；吸附率最高達(dá)98%，最低為37%，集中在 70%～90%；各種噬菌體在宿主菌中的潛伏期為180～300 min；裂解時間在400～490 min；平均釋放顆粒數(shù)最高為110～120 PFU/cell，最低為18～20 PFU/cell，集中在25～65 PFU/cell[30]。在B.abortus544中對Tb的生長特性進行了實驗，發(fā)現(xiàn)其吸附時間和潛伏期分別為90 min和120 min，裂解時間在180～240 min，顆粒釋放量為34～40 PFU/cell。因此，噬菌體的生長特性與其宿主菌密切相關(guān)。

3 布魯菌噬菌體的宿主范圍

布魯菌噬菌體可以在哪些菌中增殖以及改變增殖菌是否影響其裂解特異性，與其宿主范圍有關(guān)?？梢员籘b和Fi裂解的布魯菌株比較接近，兩者不同之處在于Tb裂解B.suis1330，而Fi則否[30]，但相關(guān)報道亦存在分歧，有報道Tb在RTD濃度時不裂解B.suis1330，也有的稱Tb和Fi兩者均可產(chǎn)生噬斑[19, 29, 31]；另一分歧是Tb能否對B.melitensis16M裂解[19, 28]。為了解不同增殖菌對噬菌體裂解特性的影響，Hammerl 等采用不同的飼養(yǎng)菌對Tb、Wb、R/C和Iz進行增殖，未發(fā)現(xiàn)噬菌體的裂解特性受到影響，也沒有觀察到噬菌體適應(yīng)新的宿主菌，如噬菌體R/C保持了對粗糙型宿主感染的特異性和唯一性；即使在不同宿主菌中增殖可能會引起噬菌體基因的改變，然而此改變與其宿主范圍的改變沒有必然聯(lián)系[30]。但是，改變宿主菌后噬菌體釋放的顆粒數(shù)會受到較大影響，因此，分型用噬菌體的增殖、鑒定、濃度及對照的選擇應(yīng)依據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格執(zhí)行，改變其中某個條件很可能出現(xiàn)不同結(jié)果。如果同一噬菌體因滴度不同而引起結(jié)果差異，使用相同的飼養(yǎng)菌增殖噬菌體可以避免這種差異；若出現(xiàn)相反的分型結(jié)果，很可能是噬菌體發(fā)生了基因突變，建議對其基因組進行測序[28]。

4 布魯菌噬菌體的溶源現(xiàn)象

溶源現(xiàn)象是由于噬菌體的基因組重組到宿主染色體中, 引起溶源性細(xì)菌在形態(tài)和生理特性方面發(fā)生改變，導(dǎo)致對同類噬菌體及其近緣噬菌體的侵染具有免疫性。感染Tb后存活下來的B.abortusS19，經(jīng)過多次傳代后PCR可檢測到最初的培養(yǎng)物中仍有其存在，然而經(jīng)絲裂霉素C處理后沒有觀察到噬菌體顆粒的釋放[28, 32]；另外，電子顯微鏡下觀察到Tb顆粒吸附到細(xì)菌表面，但是再次培養(yǎng)檢測不到噬菌體，這說明B.abortusS19可能是Tb的載體，但沒有完整的噬菌體基因組插入細(xì)菌染色體中，也沒有觀察到攜帶Tb的細(xì)菌對相同或不同的布魯菌標(biāo)準(zhǔn)噬菌體感染具有免疫力[33-34]。在對一株光滑型牛種布魯菌變異菌分型時，Tb在RTD和104×RTD均不能裂解該菌，基因組測序未發(fā)現(xiàn)噬菌體基因組的整合。超薄電子顯微鏡下觀察切片，該菌有Tb吸附，但未見噬菌體侵入菌體[35]，其原因有待進一步研究。

B.abortusS19的派生物 S19lys含有溫和噬菌體BiPBO1，Tb對溶源性菌株S19lys和原菌株具有相同的裂解作用，說明S19lys中的溫和噬菌體BiPBO1不會影響Tb在S19lys中的裂解和增殖，Tb和BiPBO1在裂解S19lys時由于形成不同形態(tài)的噬斑可將兩者區(qū)分[32]。因此，前噬菌體的存在可被噬菌體感染所誘導(dǎo)，布魯菌噬菌體裂解產(chǎn)物應(yīng)考慮溶源現(xiàn)象。

綜上所述，噬菌體裂解實驗在布魯菌分型中應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)范進行操作，使用公認(rèn)的參考品作為對照是保證分型結(jié)果正確的重要前提，噬菌體與其宿主菌相互作用、相互制約，處于動態(tài)變化中，這也是一個共進化過程，值得深入探索和研究。