重訪乙型肝炎病毒感染腎臟的意義

朱冬，楊橙，童舒平，劉少軍，王勇翔

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院泌尿外科，上海市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 3. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院腎臟科，上海 200040

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬于嗜肝DNA病毒科，基因組全長約 3.2 kb，是感染人的最小DNA病毒。迄今為止，全球約有2.5億人感染了HBV[1]。當(dāng)HBV感染者血清中的乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)持續(xù)存在超過6個(gè)月，即為慢性感染。慢性乙型肝炎患者罹患終末期肝病(包括肝硬化和肝癌)的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[2]。一般認(rèn)為，HBV感染的主要靶器官為肝臟。但流行病學(xué)研究顯示，慢性乙型肝炎患者罹患慢性腎病和腎癌的風(fēng)險(xiǎn)也顯著增加[3-5]。雖然慢性乙型肝炎相關(guān)性腎炎主要由免疫復(fù)合物(如HBsAg和抗-HBs復(fù)合物)沉積所致[6]，但許多研究已發(fā)現(xiàn)HBV感染標(biāo)記[如HBsAg、乙型肝炎核心抗原(hepatitis B core antigen，HBcAg)、HBV RNA和DNA]存在于慢性乙型肝炎患者的腎臟細(xì)胞[7-10]，特別是近來有證據(jù)顯示HBV功能性受體鈉離子/牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)和支持HBV RNA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子均在腎臟中表達(dá)[11-12]。因此，對于腎臟是否為HBV感染、表達(dá)和復(fù)制的另一靶器官，值得進(jìn)一步探討。

目前，用于治療慢性乙型肝炎的藥物包括α干擾素、聚乙二醇化α干擾素和核苷(酸)類似物，但它們都不能清除共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)而無法達(dá)到病毒學(xué)治愈的目標(biāo)[13]。因此，功能性治愈是當(dāng)前慢性乙型肝炎治療的目標(biāo)，主要指標(biāo)是HBsAg消失[13]。但當(dāng)前的藥物治療極少能達(dá)到使HBsAg消失的目標(biāo)(干擾素治療3%～7%，核苷(酸)類似物治療每年約1%)[13]。這也提示HBV可能潛伏在其他器官中。若腎臟是HBV感染、表達(dá)和復(fù)制的另一靶器官，HBV與腎臟細(xì)胞的相互作用、腎臟的抗病毒免疫反應(yīng)將是全新研究領(lǐng)域。此外，現(xiàn)有治療藥物在腎臟內(nèi)的抗病毒效應(yīng)也值得評估。本文就HBV在肝臟內(nèi)建立感染的決定因素、感染腎臟的可能性及乙型肝炎相關(guān)性腎炎的診斷和治療進(jìn)行簡要綜述。

1 HBV感染和復(fù)制

HBV為包膜病毒，其包膜含有大(large，L)、中(middle，M)和小(small，S)3種表面蛋白，合稱為HBsAg，其中由226個(gè)氨基酸(amino acid，aa)組成的S蛋白豐度最高。目前認(rèn)為S蛋白為4次跨膜蛋白，其99～169位氨基酸位于第2和第3個(gè)跨膜區(qū)且暴露在病毒表面，因包含多個(gè)能誘生中和性抗體的線性和構(gòu)型表位而被稱作抗原環(huán)(antigenic loop，AGL)，M蛋白在S蛋白N端多出55個(gè)氨基酸的PreS2區(qū)，而L蛋白則在S蛋白N端多出108或119個(gè)氨基酸的PreS1區(qū)和PreS2區(qū)。M蛋白的功能未知，L蛋白PreS1區(qū)第2位甘氨酸豆蔻?；?myristoylation)對L蛋白與NTCP的結(jié)合至關(guān)重要[14-15]。HBV先通過AGL與肝細(xì)胞表面肝素硫酸蛋白多糖(heparin sulfate proteoglycans，HSPG)結(jié)合，使病毒在肝細(xì)胞表面富集[16-17]，再通過PreS1 N端第2～48位氨基酸與NTCP結(jié)合介導(dǎo)HBV進(jìn)入肝細(xì)胞[15,18]。隨后，病毒脫去包膜，釋放核衣殼(nucleocapsid)，后者通過微管運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核，再脫殼將包裹的松弛環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)釋放入核。rcDNA可能借助細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)而轉(zhuǎn)化成cccDNA[19]。cccDNA包含2個(gè)增強(qiáng)子、4個(gè)啟動(dòng)子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件[20]，一些肝細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別和結(jié)合這些調(diào)控元件而招募細(xì)胞的RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄復(fù)合物[21]。RNA聚合酶Ⅱ以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄出4組不同長度(3.5 kb、2.4 kb、2.1 kb和0.7 kb)的病毒RNA。3.5 kb前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)編碼核心蛋白和聚合酶。聚合酶順式結(jié)合pgRNA 5′端莖環(huán)結(jié)構(gòu)(ε)并與核心蛋白二聚體及細(xì)胞因子(如Hsp90等)一起包裝形成核衣殼。與此同時(shí)，聚合酶以pgRNA為模板將第1個(gè)脫氧核苷酸(dT)共價(jià)連接至聚合酶TP區(qū)第63位酪氨酸(該過程稱為蛋白引發(fā))[22]，從而起始病毒DNA復(fù)制。在核衣殼內(nèi)，聚合酶依次以pgRNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄形成負(fù)鏈DNA，再降解pgRNA，并以負(fù)鏈DNA為模板合成正鏈DNA。3.5 kb的前C區(qū)RNA(precore RNA，pcRNA)編碼乙型肝炎 e 抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)。2.4 kb和2.1 kb mRNA分別指導(dǎo)翻譯L和M/S包膜蛋白。成熟的核衣殼被L、M和S包膜蛋白包裹形成完整的病毒顆粒，后者通過多囊泡體相關(guān)途徑分泌出胞[23-25]。S包膜蛋白也以亞病毒顆粒的形式大量釋放，其血中的濃度是完整病毒顆粒的1 000～10 000倍，是HBsAg的主要來源。

2 HBV感染人肝臟的決定因素

HBV的嗜肝性由諸多因素決定。首先，暴露于HBV表面的L蛋白PreS1區(qū)與肝細(xì)胞表面的NTCP特異性作用是關(guān)鍵。最近，不同種屬NTCP與PreS1結(jié)合能力測定及表達(dá)人NTCP的不同種屬肝細(xì)胞的HBV易感性檢測實(shí)驗(yàn)提供了重要證據(jù)。盡管來自人、小鼠、大鼠、狗、豬和獼猴的NTCP高度同源，但獼猴NTCP第157～165位氨基酸不同于人NTCP，導(dǎo)致PreS1多肽不能結(jié)合獼猴NTCP及HBV不能感染獼猴肝細(xì)胞[26]。小鼠NTCP雖然能結(jié)合Pres1多肽，但不介導(dǎo)HBV感染小鼠肝細(xì)胞，這主要是小鼠與人NTCP第84～87位氨基酸序列差異所致[15,18]。通過腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)載體將人NTCP基因?qū)胄∈蟆⒋笫蟆⒐?、豬和獼猴原代肝細(xì)胞，促使這些細(xì)胞表達(dá)人NTCP。HBV攻毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)只有表達(dá)了人NTCP的豬和獼猴原代肝細(xì)胞建立了感染，而小鼠、大鼠、狗的原代肝細(xì)胞不能被感染[26]。如果將穩(wěn)定表達(dá)人NTCP的小鼠肝細(xì)胞系與人HepG2細(xì)胞融合，這樣的融合細(xì)胞卻能支持HBV感染[27]。這些結(jié)果提示，除了NTCP，還有其他宿主因子對HBV建立感染至關(guān)重要。

肝細(xì)胞表達(dá)的肝富集轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合cccDNA的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子而促使HBV RNA轉(zhuǎn)錄是HBV嗜肝性的另一個(gè)重要因素。通過啟動(dòng)子活性檢測以及點(diǎn)突變和缺失突變、轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的凝膠遷移等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HNF4α、HNF3和RxRα/PPARα等是促使HBV RNA轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[28-31]。非肝來源的NIH 3T3細(xì)胞不支持HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，但若將HNF4α或RxRα/PPARα與含 1.3 倍體HBV基因組表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染該細(xì)胞，通過RNA/DNA印跡法證明了HBV RNA轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制[28]。經(jīng)尾靜脈高壓水動(dòng)力注射將HBV表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠(如BALB/c和C57BL/6品系)肝臟可起始病毒復(fù)制，因此小鼠肝細(xì)胞包含支持HBV轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄因子[32]。但表達(dá)人NTCP的小鼠或小鼠原代肝細(xì)胞仍不能被HBV感染[27,33]，提示從HBV侵入肝臟到cccDNA形成的某些環(huán)節(jié)在正常小鼠肝細(xì)胞內(nèi)無法完成，其中可能的關(guān)鍵宿主因子還有待鑒定和研究。

3 腎臟具備HBV感染和復(fù)制的因素

眾多研究通過免疫組織化學(xué)、原位HBV RNA和DNA雜交等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了HBV感染標(biāo)記(如HBsAg、HBcAg、HBV RNA和DNA)存在于慢性乙型肝炎患者的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞[7-10]。這些腎臟細(xì)胞內(nèi)的HBV標(biāo)記可能是細(xì)胞吞噬血液中的病毒顆粒(或與抗體形成復(fù)合物)所致，也可能由整合在染色體上的HBV DNA所編碼，或HBV感染這些腎臟細(xì)胞所致。HBV RNA和DNA陽性提示腎臟細(xì)胞能支持HBV轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制。提取腎組織總DNA進(jìn)行DNA印跡法，發(fā)現(xiàn)大部分HBV DNA顯著長于3.2 kb，提示HBV DNA整合于宿主細(xì)胞染色體，也有少部分HBV DNA為復(fù)制中間體[34]。但這些研究缺少嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆肿由飳W(xué)實(shí)驗(yàn)以檢測驅(qū)動(dòng)HBV復(fù)制的天然模板——cccDNA，因此HBV是否在腎臟建立感染還有待證實(shí)。

用含1.2或1.3倍HBV基因組的質(zhì)粒構(gòu)建轉(zhuǎn)基因C57BL/6小鼠，轉(zhuǎn)基因鼠的肝臟和腎臟都高表達(dá)前基因組RNA和PreS/S mRNA[35-36]，這些病毒RNA再編碼病毒復(fù)制和組裝所需的核心蛋白、聚合酶、包膜蛋白等，通過DNA印跡法等技術(shù)證明HBV在轉(zhuǎn)基因鼠肝臟和腎臟復(fù)制[35,36]。本研究團(tuán)隊(duì)曾構(gòu)建了整合HBV單倍體基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠[37]，雖然該系小鼠無HBV顆粒產(chǎn)生，但肝和腎小管上皮細(xì)胞都表達(dá)了HBsAg和核心蛋白[37]，通過蛋白免疫印跡和組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞富集的轉(zhuǎn)錄因子如HNF4、HNF3、HNF1、RxRα/PPARα等在腎臟表達(dá)[12,38-41]。這些證據(jù)表明，腎臟提供了支持HBV RNA轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制的必要因素。此外，用HBV表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293人胚腎細(xì)胞起始HBV轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，提取細(xì)胞總DNA，DNA印跡法檢測發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞支持cccDNA形成[42]，提示腎臟細(xì)胞可提供必需的宿主因子，促使HBV核衣殼入核及將rcDNA修復(fù)成cccDNA。

作為HBV低親合力受體的HSPG(如Glypican 5)[16-17]在肝臟和腎臟(尤其是腎小管上皮細(xì)胞)均表達(dá)[43-44]。通過免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，作為HBV高親合力受體的NTCP在人肝臟和腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)(數(shù)據(jù)來源于蛋白定位數(shù)據(jù)庫https://www.proteinatlas.org)。通過蛋白免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，NTCP在小鼠肝臟、腎臟和胰臟表達(dá)[11]。這些數(shù)據(jù)提示，人腎臟因表達(dá)NTCP而可能成為HBV感染的另一重要靶器官。

4 乙型肝炎相關(guān)性腎炎

Combes于1971年最先在1例膜性腎病患者的腎活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)HBsAg沉積在腎小球基底膜上[45]。乙型肝炎相關(guān)性腎病主要包括乙型肝炎相關(guān)膜性腎病和乙型肝炎相關(guān)膜增生性腎小球腎炎[6]，還包括乙型肝炎相關(guān)性冷球蛋白血癥的腎損害及在我國尚無報(bào)道的乙型肝炎相關(guān)性結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎。我國于1989年將乙型肝炎相關(guān)性腎病命名為HBV相關(guān)性腎小球腎炎。

目前，乙型肝炎相關(guān)性腎炎的診斷依據(jù)包括：①血清HBV標(biāo)記陽性；②患腎病或腎炎并除外其他腎小球疾?。虎勰I小球中有一種或多種 HBV 抗原沉積；④腎臟病理改變，絕大多數(shù)為膜性腎病，少數(shù)為膜增生性腎炎和系膜增生性腎炎。根據(jù)2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)腎臟病學(xué)組指南，乙型肝炎相關(guān)性腎炎的確診標(biāo)準(zhǔn)為：同時(shí)具備上述第①、②和③條；同時(shí)具備上述第①、②條依據(jù)，且第④條依據(jù)中為膜性腎病；個(gè)別患者具備上述第②、③條依據(jù)，血清HBV標(biāo)記陰性也可確診。僅具備第①和②條但不具備③時(shí)，不能進(jìn)行診斷。

腎活檢病例中，血清HBsAg陽性比例約為6.8%(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2017—2018年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù))，與人群中HBV感染率相當(dāng)。約7.6%的血清HBsAg陽性患者腎組織中至少一種HBV抗原陽性，按以上診斷標(biāo)準(zhǔn)可診斷為乙型肝炎相關(guān)性腎炎。

但現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)并非十全十美。例如，腎組織活檢HBV陽性并不能完全等同于HBV感染就是腎炎的病因；而腎組織中HBV抗原陰性，也不能完全排除其作為腎炎的病因。在臨床實(shí)踐中，僅根據(jù)腎小球中滯留的HBV標(biāo)記進(jìn)行乙型肝炎相關(guān)性腎炎的診斷尚存在假陽性或假陰性，還需更多證據(jù)來輔助診斷。例如，通過抗病毒治療使血清HBV抗原和病毒DNA拷貝數(shù)下降，如果腎病獲得緩解則支持乙型肝炎相關(guān)性腎炎的診斷，如果腎病并無改善則可能不支持該診斷。此外，一些生物標(biāo)記可提高乙型肝炎相關(guān)性腎炎診斷的特異性。最近，多項(xiàng)研究表明，磷脂酶A2受體(phospholipase A2 receptor，PLA2R)的抗體是特發(fā)性膜性腎病的有效標(biāo)記，可用作HBV抗原-抗體沉積合并原發(fā)性膜性腎病與HBV抗原-抗體沉積所致膜性腎病的鑒別診斷[46-50]。

乙型肝炎相關(guān)性腎炎治療以抗病毒治療為主[6]。兒童首選干擾素，成人則多選擇核苷類抗病毒藥物，不主張盲目使用免疫抑制劑。

5 乙型肝炎與腎移植

腎移植術(shù)后移植腎的功能和長期存活率與供、受體的HBV感染和復(fù)制情況密切相關(guān)。腎移植受者需長期服用免疫抑制劑，如果存在HBV感染因素，將對移植腎的功能產(chǎn)生重要影響。一項(xiàng)隨訪10年的研究表明，移植腎的長期存活率在HBV感染的受者中比無HBV感染受者中明顯降低，HBV感染受者移植腎的丟失風(fēng)險(xiǎn)增加近4倍[51]。Chen等回顧了322例術(shù)前抗-HBc陽性/HBsAg陰性的腎移植受者，術(shù)后發(fā)現(xiàn)HBV活化率為4.7%[52]。另一項(xiàng)類似研究隨訪了631例受者，術(shù)前91.4%受者抗-HBsAg陽性；隨訪中位時(shí)間為151個(gè)月時(shí)，HBV活化率為6.7%；所有受者在未接受預(yù)防治療的情況下抗-HBs效價(jià)穩(wěn)定，僅2例出現(xiàn)HBV活化[53]。這些研究表明，在接受免疫抑制劑治療時(shí)腎移植受者HBV活化率與受者體內(nèi)抗-HBs效價(jià)呈負(fù)相關(guān)。若供體存在HBV感染，針對腎移植受者的HBV感染干預(yù)措施不同。若供體HBsAg陽性，HBsAg陽性受體需接受抗病毒(如恩替卡韋)治療。若供體HBsAg/抗-HBc陽性且受體HBsAg抗體效價(jià)>10 IU/L，則受者移植后不需接受治療；若受者HBsAg抗體效價(jià)<10 IU/L，則需HBV疫苗再次免疫、HBV免疫球蛋白中和病毒或核苷類似物抗病毒治療[54]。目前，腎移植術(shù)后HBV是否潛伏在移植腎內(nèi)仍未知，尚需進(jìn)一步證實(shí)。

6 結(jié)語

腎臟細(xì)胞內(nèi)的HBV抗原可能改變細(xì)胞的生理和生化功能而導(dǎo)致腎臟功能受損。用HBV表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腎臟細(xì)胞(如腎小管上皮細(xì)胞和腎小球間質(zhì)細(xì)胞)發(fā)現(xiàn)HBx調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[55-60]。在84%的乙型肝炎相關(guān)腎小球腎炎患者中，HBx的反式調(diào)控區(qū)發(fā)生突變[61]。本研究團(tuán)隊(duì)曾發(fā)現(xiàn)，表達(dá)HBsAg的HBV轉(zhuǎn)基因鼠中血清補(bǔ)體C3降低，而腎組織補(bǔ)體C3升高[37]；類似改變也在HBsAg陽性乙型肝炎患者中發(fā)現(xiàn)，且補(bǔ)體C3在腎臟沉積與腎臟損傷呈正相關(guān)[62]。因此，研究和區(qū)分腎臟細(xì)胞內(nèi)HBV標(biāo)記的來源非常重要，針對不同來源，采取的主要治療措施可能不同。若腎臟細(xì)胞內(nèi)HBV標(biāo)記來自病毒顆粒內(nèi)吞或HBV感染，降低病毒載量的抗病毒治療就顯得更為重要；若標(biāo)記來自HBV基因組整合，目前尚處于研發(fā)階段的靶向病毒抗原的免疫治療(如抗體治療[63-65]和嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫治療[66-67])可能具有重要的應(yīng)用前景。

乙型肝炎患者血中HBsAg濃度可高達(dá)300 μg/mL。過量的HBsAg封閉中和性抗體，除導(dǎo)致病毒逃逸外，還促使免疫復(fù)合物沉積于腎小球基底膜。最近多項(xiàng)證據(jù)表明HBsAg還干擾宿主抗病毒免疫反應(yīng)[68-73]。因此，尚處于研發(fā)階段的靶向HBsAg的抗體治療或抑制HBsAg分泌并促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)降解的化合物治療[74]有望改善慢性乙型肝炎患者的肝臟和腎臟功能。