宮頸鱗狀細胞癌中SIX1、SIX2、MMP11的表達及臨床意義

賀敏，陳勇偉

十堰市太和醫(yī)院1婦科，2泌尿外科，湖北 十堰 442000

宮頸鱗狀細胞癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展具有相對鮮明的階段性特征，即從低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變發(fā)展至高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變，甚至癌變發(fā)展為浸潤癌[1]。腫瘤細胞具有明顯的增殖和轉(zhuǎn)移能力[2]。基質(zhì)金屬蛋白酶11（matrix metalloproteinase 11，MMP11）是基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族中的重要成員，對細胞外基質(zhì)成分的降解作用較強，并能夠促進腫瘤細胞的遷移[3]。同源異型蛋白SIX1和同源異型蛋白SIX2屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以調(diào)控下游多種基因的表達，尤其是與腫瘤細胞增殖和遷移有關(guān)的基因。本研究探討了宮頸鱗狀細胞癌中SIX1、SIX2和MMP11表達情況的相關(guān)性及臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年9月至2014年8月十堰市太和醫(yī)院收治的行宮頸鱗狀細胞癌根治術(shù)的宮頸鱗狀細胞癌患者。納入標準：①行全子宮、雙附件及區(qū)域淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后均輔以放療、化療（2～4個療程），治療方法無明顯差別；②均經(jīng)病理學(xué)檢查確診；③符合世界衛(wèi)生組織（WHO）關(guān)于宮頸鱗狀細胞癌的診斷標準[4]；④臨床資料完整；⑤術(shù)后石蠟標本均于病理科保存完整。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②病理形態(tài)中合并腺癌、肉瘤成分；③術(shù)前接受過放療、化療等抗腫瘤治療。根據(jù)納入、排除標準，本研究共納入125例宮頸鱗狀細胞癌患者，患者年齡為35～78歲，平均年齡為（54.2±9.4）歲。另選取39例宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變患者，年齡為32～68歲，平均年齡為（50.1±10.2）歲；選取39例宮頸低級別上皮內(nèi)瘤變患者，年齡為30～59歲，平均年齡為（42.1±10.7）歲；選取39例慢性宮頸炎患者，年齡為30～65歲，平均年齡為（40.3±9.8）歲。全部患者的年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。收集經(jīng)病理確診的宮頸病變患者的術(shù)后石蠟包埋組織標本。

1.2 檢測方法

全部患者的術(shù)后組織標本均應(yīng)用中性福爾馬林緩沖液固定，切取厚度為2 mm的組織置于包埋盒內(nèi)，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片后置于膠片上。SIX1、SIX2和MMP11均為濃縮液，先行預(yù)實驗，選擇最佳顯色的濃度用于正式實驗（最佳顯色濃度：SIX1 為1∶100，SIX2 為1∶200，MMP11 為1∶300）。正式實驗均采用免疫組化二步法進行檢測，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，實驗操作嚴格做好質(zhì)量控制工作，減少人為誤差。

1.3 結(jié)果判定

對SIX1、SIX2和MMP11染色結(jié)果的判斷標準由病理科醫(yī)師參照相關(guān)文獻[5-6]進行適當修改。SIX1、SIX2和MMP11定位于細胞質(zhì)和部分細胞膜，陽性細胞為淺黃色、黃色和棕黃色。根據(jù)染色強度和陽性細胞所占百分比進行評分。染色強度：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞所占百分比：在400倍視野下計算染色細胞占視野細胞總數(shù)的百分比，共計數(shù)5個視野，取平均值，其中，＜5%為0分，5%～10%為1分，11%～30%為2分，31%～50%為3分，＞50%為4分。兩項得分相加為最終評分，最終評分≤2分為陰性，＞2分為陽性。計算不同組織中SIX1、SIX2和MMP11的陽性表達率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 6.12軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson法進行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸病變患者宮頸病變組織中SIX1、SIX2和MMP11陽性表達情況的比較

宮頸鱗狀細胞癌組織、宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變組織、宮頸低級別上皮內(nèi)瘤變組織、慢性宮頸炎組織中SIX1、SIX2和MMP1的陽性表達率比較，差異均有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（χ2=31.418、41.150、21.826，P＜0.01）。宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP1的陽性表達率均明顯高于宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變組織、宮頸低級別上皮內(nèi)瘤變組織和慢性宮頸炎組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同宮頸病變組織中SIX1、SIX2和MMP11陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 不同臨床特征宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP11陽性表達情況的比較

腫瘤最大徑≥2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、增殖指數(shù)≥25%的宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1的陽性表達率均高于腫瘤最大徑＜2 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、增殖指數(shù)＜25%的宮頸鱗狀細胞癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=17.487、20.028、6.074，P＜0.05）；不同脈管瘤栓情況宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤最大徑≥2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、增殖指數(shù)≥25%的宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX2的陽性表達率均明顯高于腫瘤最大徑＜2 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、增殖指數(shù)＜25%的宮頸鱗狀細胞癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.893、15.012、12.561，P＜0.01）；不同脈管瘤栓情況宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX2的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤最大徑≥2 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有脈管瘤栓的宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中MMP11的陽性表達率均明顯高于腫瘤最大徑＜2 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無脈管瘤栓的宮頸鱗狀細胞癌患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.468、32.200、15.873，P＜0.01）；不同增殖指數(shù)宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中MMP11的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 不同臨床特征宮頸鱗狀細胞癌患者宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP11的陽性表達情況（n=125）

2.3 宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP11表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1與MMP11的表達呈正相關(guān)（r=0.55，P=0.029），SIX2與 MMP11的表達呈正相關(guān)（r=0.49，P=0.042），SIX1與SIX2的表達未見明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

宮頸鱗狀細胞癌發(fā)生于宮頸表面的鱗狀上皮，其發(fā)生、發(fā)展與人乳頭瘤病毒感染有關(guān)，人乳頭瘤病毒感染會導(dǎo)致細胞發(fā)生癌變，從而形成挖空細胞。病情進展時，宮頸鱗狀上皮發(fā)生異型增生。多種腫瘤相關(guān)基因在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達異常。對于浸潤性宮頸鱗狀細胞癌，常表現(xiàn)出非角化性鱗狀細胞癌的特征。宮頸鱗狀細胞癌患者的預(yù)后較差，生存時間較短，但是，不同宮頸鱗狀細胞癌患者的生存時間并不完全一致。臨床評估宮頸鱗狀細胞癌患者預(yù)后的輔助指標包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、周圍組織的侵犯情況等，這些指標不能從根本上判斷患者的預(yù)后，而分子生物學(xué)的發(fā)展為宮頸鱗狀細胞癌患者預(yù)后的判斷提供了可能。有研究顯示，在腫瘤進展的過程中，腫瘤細胞可分泌MMP，目前發(fā)現(xiàn)MMP家族共包括28個成員，在大部分惡性腫瘤中均有表達，其功能各不相同[7]。MMP11是MMP家族的重要成員，可以有效分解纖溶酶原及膠原，從而促進腫瘤的遷移[8]。也有研究認為MMP11能有效調(diào)節(jié)腫瘤間質(zhì)的微血管新生[9]。MMP11在腫瘤病變過程中能降解非細胞外基質(zhì)的絲氨酸蛋白酶抑制劑和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1，在細胞內(nèi)以45 kDa的活化酶形式進行釋放，在細胞外被激活，調(diào)控下游蛋白的表達。細胞間的黏附作用常與MMP11關(guān)系密切，其可以使腫瘤細胞間的連接松動，使細胞脫離原發(fā)灶，進而形成轉(zhuǎn)移灶[10]。SIX1和SIX2屬于腫瘤促進因子，可以作為轉(zhuǎn)錄因子參與多種組織的形成和發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn)，SIX1在正常成熟組織中的表達水平較低，而在惡變組織中的表達水平明顯升高；另外，SIX1轉(zhuǎn)錄時能夠調(diào)控多種促癌基因的表達和腫瘤細胞的增殖[11-12]。有研究認為，SIX1能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子信號通路的過表達，激活血管內(nèi)皮生長因子，有效調(diào)控腫瘤間質(zhì)的脈管生成；SIX1能夠抑制上皮細胞的黏附作用和細胞間的結(jié)合程度，促進腫瘤的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移[13]。SIX2還具有調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，能夠使腫瘤浸潤的前沿枝芽狀的細胞表達波形蛋白（vimentin）等標志物，進而增強腫瘤細胞和間質(zhì)細胞的同源性。SIX1對腫瘤的調(diào)控作用還表現(xiàn)在對MMP的調(diào)節(jié)方面，其能夠抑制間質(zhì)的轉(zhuǎn)移屏障作用，使腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[14]。SIX2還能夠通過調(diào)控B細胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白等的表達從而發(fā)揮抑制腫瘤細胞凋亡的作用。因此，與SIX1相比，SIX2的作用可能更加廣泛，其調(diào)控腫瘤進展的作用通路更多[15]。

本研究結(jié)果顯示，不同宮頸病變組織中SIX1、SIX2和MMP11的陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示SIX1、SIX2和MMP11參與宮頸病變的發(fā)生與發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1、SIX2和MMP11的表達情況可能與腫瘤最大徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系最大，提示SIX1、SIX2和MMP11可以促進宮頸鱗狀細胞癌的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞呈樹根狀向周圍組織生長，對局部組織和周圍鄰近器官具有明顯的破壞作用。本研究結(jié)果顯示，宮頸病變組織中SIX1和SIX2的陽性表達率可能與增殖指數(shù)有關(guān)，MMP11的陽性表達率可能與脈管瘤栓情況有關(guān)，提示SIX1和SIX2能夠促進宮頸鱗狀細胞癌細胞的增殖，MMP11能夠促進宮頸鱗狀細胞癌組織的脈管侵犯。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，宮頸鱗狀細胞癌組織中SIX1和MMP11、SIX2和MMP11的表達均呈正相關(guān)（r=0.55、0.49，P＜0.05），提示SIX1、SIX2可能通過調(diào)節(jié)MMP11的表達從而發(fā)揮促進宮頸鱗狀細胞癌細胞轉(zhuǎn)移的作用。由于以上因素均與腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)，因此，三者的異常表達預(yù)示著宮頸鱗狀細胞癌不良生物學(xué)行為的發(fā)生。這為臨床提供了輔助判斷宮頸鱗狀細胞癌生物學(xué)行為的指標，也為宮頸鱗狀細胞癌患者個體化治療的實施提供了支持。有研究發(fā)現(xiàn)，SIX家族通過對MMP11進行調(diào)控，調(diào)節(jié)腫瘤的生長和侵襲過程[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)SIX1和SIX2的表達與脈管癌栓無明顯相關(guān)性，提示二者對脈管的浸潤作用不明顯，但是其具體機制尚需要更多的實驗加以證實[18-19]。應(yīng)用其他實驗手段檢測SIX1和SIX2的表達也是驗證其與宮頸鱗狀細胞癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移關(guān)系的重要手段。

綜上所述，SIX1、SIX2和MMP11在宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率高，SIX1、SIX2的陽性表達率可能與宮頸鱗狀細胞癌的腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、增殖指數(shù)有關(guān)，MMP11的陽性表達率可能與宮頸鱗狀細胞癌的腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、脈管瘤栓情況有關(guān)。SIX1、SIX2和MMP11對宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展具有一定的調(diào)節(jié)作用。SIX1和SIX2可能通過調(diào)控MMP11對宮頸鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展起到一定的調(diào)節(jié)作用。SIX1、SIX2和MMP11的表達可能在宮頸鱗狀細胞癌患者預(yù)后的判斷中具有一定的參考價值。本研究主要側(cè)重于對SIX1、SIX2和MMP11蛋白的表達情況進行研究，其mRNA的改變可能與蛋白的表達具有協(xié)同作用，后續(xù)研究應(yīng)針對SIX1mRNA、SIX2mRNA和MMP11mRNA的表達進行實驗設(shè)計，對闡明SIX1、SIX2與MMP11的關(guān)聯(lián)性及其作用機制將具有更大的意義。