TUBB6在胃癌中的表達(dá)情況及臨床意義

張敏，左云，盧瑋冬

張家港市第一人民醫(yī)院（蘇州大學(xué)附屬張家港醫(yī)院）腫瘤科，江蘇 張家港 215600

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居全部惡性腫瘤第4位，病死率居全部惡性腫瘤第2位[1]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，與胃癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物的研究日益得到關(guān)注。β微管蛋白Ⅴ（tubulin beta 6 classⅤ，TUBB6）是β微管蛋白的亞型之一，由TUBB6基因編碼。TUBB6廣泛表達(dá)于人類的各種正常組織中，其在乳腺組織和肺組織中的表達(dá)量分別占β微管蛋白表達(dá)量的11%和10%[2]。TUBB6也廣泛表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，其在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌細(xì)胞中均異常高表達(dá)[3-7]。但目前關(guān)于TUBB6在胃癌中表達(dá)情況的報(bào)道較少，本研究通過免疫熒光染色和免疫組織化學(xué)染色方法，探討TUBB6在胃癌細(xì)胞中的定位及在胃癌組織中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)情況與胃癌患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2017年1—12月于張家港市第一人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的90例胃癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡為18～85歲；經(jīng)病理檢查確診為胃癌；預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月。90例患者中，男61例，女29例；年齡為31～83歲，中位年齡為65.5歲；病理類型：腺癌66例（乳頭狀腺癌3例，黏液腺癌5例，管狀腺癌58例），印戒細(xì)胞癌13例，未分化癌11例；分化程度：中/高分化16例，低分化60例，未分化14例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移3例（1例卵巢轉(zhuǎn)移，1例結(jié)腸轉(zhuǎn)移，1例肝實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移），無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移87例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期54例。所有患者術(shù)前均未行放療或化療等抗腫瘤治療。收集患者的胃癌組織90例及癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）45例進(jìn)行研究，術(shù)中取得標(biāo)本后立即轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞及主要試劑

細(xì)胞：正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和胃癌細(xì)胞株BGC-823（低分化）均購自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司。主要試劑：TUBB6抗體、Alexa Fluor 555標(biāo)記的山羊抗鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）（H+L）高交叉吸附的二抗均購自美國Proteintech公司，兔抗人TUBB6多克隆抗體購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，鼠抗兔UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫熒光染色

將正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和胃癌細(xì)胞株BGC-823培養(yǎng)后，制成（1～2）×104/ml的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。待細(xì)胞長成單層后，采用4%多聚甲醛將細(xì)胞固定；0.2%Triton破膜穿孔；滴加封閉液于濕盒中，室溫封閉；采用抗體稀釋液稀釋一抗（TUBB6抗體，1∶200稀釋），滴加一抗，置于濕盒內(nèi)，37℃孵育；采用抗體稀釋液稀釋二抗（Alexa Fluor 555標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，1∶300稀釋），滴加二抗，置于濕盒內(nèi)，37℃保溫、避光；熒光顯微鏡鏡檢、拍照。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

90例胃癌組織和45例癌旁組織標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。將組織切片進(jìn)行脫蠟和水化；采用3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原熱修復(fù)；滴加10%血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，依次滴加一抗（兔抗人TUBB6多克隆抗體，1∶500稀釋）和二抗（鼠抗兔S-P超敏試劑盒）；加入二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染；最后脫水、封片、鏡檢。

1.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

TUBB6定位于細(xì)胞質(zhì)，陽性染色細(xì)胞中可見棕色顆粒。由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行判斷，在高倍鏡（×400）下觀察5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評分：＜1%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。染色強(qiáng)度評分與陽性細(xì)胞所占百分比評分相乘，0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中度陽性（++），9～12分為強(qiáng)陽性（+++）。其中，≥1分即為陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUBB6在不同細(xì)胞株中的免疫熒光染色結(jié)果

TUBB6在正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1、胃癌細(xì)胞株BGC-823中均可檢測到免疫熒光信號，且胃癌細(xì)胞株BGC-823中的熒光染色強(qiáng)于正常胃黏膜上皮細(xì)胞株 GES-1（圖 1A、2A）；經(jīng) 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）核復(fù)染（圖1B、2B），進(jìn)一步提示TUBB6定位在細(xì)胞質(zhì)。

圖1 正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1中TUBB6的表達(dá)情況（免疫熒光染色，×400）

圖2 胃癌細(xì)胞株BGC-823中TUBB6的表達(dá)情況（免疫熒光染色，×400）

2.2 胃癌組織和癌旁組織中TUBB6表達(dá)情況的比較

TUBB6在胃癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈不同程度的表達(dá)；TUBB6在癌旁組織中也表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，但染色較淺（圖3、圖4）。分析45例胃癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中TUBB6的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，胃癌組織中TUBB6的陽性表達(dá)率為88.9%（40/45），低于癌旁組織的68.9%（31/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.404，P＜0.05）。

圖3 胃癌組織及癌旁組織中TUBB6的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）

圖4 胃癌組織中TUBB6的染色情況（免疫組織化學(xué)染色，×400）

2.3 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中TUBB6的表達(dá)情況

90例胃癌組織中，TUBB6的陽性表達(dá)率為88.9%（80/90）。不同性別、年齡的胃癌患者胃癌組織中TUBB6的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同病理類型、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期及Lauren分型的胃癌患者胃癌組織中TUBB6的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

3 討論

胃癌是臨床中常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類的生命健康，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌由多種基因調(diào)控失衡發(fā)展而來，與原癌基因C-erbB-2、c-myc、ras的激活和抑癌基因p21、p53的失活有關(guān)，上述基因表達(dá)的變化對胃癌的生物學(xué)行為及預(yù)后均產(chǎn)生影響[8-10]。目前在胃癌中尚缺乏特異性或敏感性高的生物標(biāo)志物，由于部分生物標(biāo)志物受技術(shù)和成本的限制，尚未進(jìn)入臨床應(yīng)用階段，因此尋找一些新的具有臨床應(yīng)用價(jià)值的生物標(biāo)志物對胃癌的研究具有重要意義。

表1 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中TUBB6表達(dá)情況的比較（n=90）

微管是細(xì)胞骨架的重要組成部分，普遍存在于真核細(xì)胞中，參與細(xì)胞形態(tài)的維持、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂及分化等過程。微管由微管蛋白和微管輔助蛋白組成[11]。微管蛋白是一種異質(zhì)二聚體蛋白，由α微管蛋白和β微管蛋白組成，至少有6個(gè)α微管蛋白和7個(gè)β微管蛋白亞型，兩者在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)保持高度動(dòng)態(tài)平衡[12]。微管蛋白是有絲分裂時(shí)紡錘體的組成部分，也是抗微管藥物的主要作用靶點(diǎn)。通過一種新的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）技術(shù)，可以精確地測量出人類β微管蛋白亞型Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb、Ⅲ、Ⅳa、Ⅳb、Ⅴ和ⅥmRNA的表達(dá)水平，它們分別由TUBB、TUBB2A、TUBB2B、TUBB3、TUBB4、TUBB2C、TUBB6和TUBB1基因編碼[2]。

Verdier-Pinard等[13]首次在人類細(xì)胞系中檢測到TUBB6，并發(fā)現(xiàn)在上皮樣卵巢癌細(xì)胞系Hey中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，TUBB6在具有分泌功能的輸卵管上皮細(xì)胞中具有組織特異性；TUBB6在漿液性卵巢癌中高表達(dá)，尤其是在分化較差、乳腺癌易感基因（breast cancer susceptibility gene，BRCA）突變的漿液性卵巢癌中，TUBB6的表達(dá)水平更高[6]。漿液性卵巢癌中TUBB6高表達(dá)可能與漿液性卵巢癌的發(fā)展有關(guān)，具有遷移能力的輸卵管上皮細(xì)胞脫落，然后附著于鄰近的卵巢上皮細(xì)胞，是卵巢癌起始和惡性播散的來源[14-15]。TUBB6的異常表達(dá)提示輸卵管上皮分泌細(xì)胞的異型性是癌前病變的表現(xiàn)。研究表明，在浸潤性乳腺癌中TUBB6呈高表達(dá)，尤其是低分化浸潤性乳腺癌，提示TUBB6的高表達(dá)與乳腺癌的分化程度及惡性轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。另有研究表明，TUBB6在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，提示TUBB6可作為非小細(xì)胞肺癌的生物標(biāo)志物[5]。在女性結(jié)直腸癌及轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中TUBB6呈高表達(dá)，且表現(xiàn)出較差的預(yù)后，提示TUBB6可作結(jié)直腸癌侵襲性及預(yù)后的預(yù)測因子[7]。在非腫瘤疾病中，TUBB6突變與常染色體顯性非進(jìn)行性先天性面癱、雙側(cè)上瞼下垂和腭咽功能障礙有關(guān)[16]。

TUBB6作為微管蛋白亞型之一，其表達(dá)水平同樣也影響細(xì)胞分裂和抗微管藥物的敏感性。研究表明，TUBB6的過表達(dá)會破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，抑制微管組裝，改變微管的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性，并促使微管從中心體蛋白分離，進(jìn)而引起細(xì)胞分裂，并對紫杉醇耐藥[17-19]。而微管穩(wěn)定藥物紫杉醇可增加具有組裝能力的微管蛋白補(bǔ)丁，抑制微管分離，穩(wěn)定微管，進(jìn)而抑制細(xì)胞分裂，消除TUBB6過表達(dá)的表型效應(yīng)。此外，TUBB6過表達(dá)或缺失均會抑制有絲分裂，影響微管的穩(wěn)定性或動(dòng)態(tài)行為，從而抑制細(xì)胞增殖。另有研究發(fā)現(xiàn)，盡管TUBB6的過表達(dá)存在毒性作用（如破壞細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、抑制微管組裝和藥物耐藥等），但在某些細(xì)胞中，少量的TUBB6表達(dá)對維持微管的可塑性和細(xì)胞分裂是必需的[20]。由于TUBB6表達(dá)的獨(dú)特性以及一些惡性腫瘤的特征性表現(xiàn)（如分化差、轉(zhuǎn)移性等），提示TUBB6表達(dá)情況的改變可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[4]。因此可推測，TUBB6過表達(dá)在惡性腫瘤中可能引起惡性生物學(xué)行為，如分裂增殖、轉(zhuǎn)移、浸潤、侵襲等，微管穩(wěn)定藥物如紫杉醇則可抑制TUBB6過表達(dá)引起的惡性生物學(xué)行為，達(dá)到治療的目的。

本研究中，TUBB6定位于胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，與之前的研究結(jié)果一致[4]。既往研究證實(shí)，TUBB6在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）[5]。本研究結(jié)果表明，胃癌組織及其對應(yīng)的癌旁組織中TUBB6的陽性表達(dá)率分別為88.9%（40/45）和68.9%（31/45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。既往研究表明，在分化差的漿液性卵巢癌、低分化浸潤性乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、女性結(jié)直腸癌及轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中，TUBB6均呈高表達(dá)，提示TUBB6高表達(dá)與腫瘤的預(yù)后、分化程度、侵襲性、惡性轉(zhuǎn)移有關(guān)[4-7]。本研究結(jié)果顯示，不同病理類型、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期及Lauren分型的胃癌患者胃癌組織中TUBB6的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可推測TUBB6可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，可作為胃癌的生物標(biāo)志物，并可能預(yù)測患者預(yù)后。

綜上所述，TUBB6在胃癌組織中的表達(dá)水平較高，且其表達(dá)情況與患者的臨床特征有關(guān)，可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系，可作為胃癌的生物標(biāo)志物。